摘要：目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒。利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株。T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果。CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能。结果 成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高。经PCR产物测序和Western blot验证获得了3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能。结论 成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDO1对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础。

摘要：近来，乙型肝炎抗病毒治疗的原则已为广大临床医生所接受。目前治疗原则是基于丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和乙型肝炎病毒（HBV）DNA水平所制订，其目的是降低或抑制病毒DNA，从而达到防止疾病进展的作用。在这一原则和目标中，治疗必然是长期的，但治疗对象的选择、终点的确定、耐药株的产生和处理，以及有无预测治疗效果的时间点等诸多现实和重要的问题是临床实践中必需回答的。

摘要：目的筛选并构建肝再生增强因子(ALR)基因的最佳RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,为研究ALR基因表达下调后对肝癌细胞生物学特性的影响提供依据。方法针对ALR基因序列设计并合成4个siRNA靶点,酶切连接GV118-GFP载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定;在包含ALR基因的质粒中以PCR法扩增出ALR基因,克隆至慢病毒载体GV143,构建ALR基因的过表达质粒,将RNAi重组慢病毒载体和ALR的基因表达质粒共转染293T细胞,用western blot检测其对目的基因ALR的敲减效率。结果酶切鉴定证实成功构建了ALR RNAi慢病毒载体及ALR基因过表达载体。不同浓度干扰质粒(0.4μg和0.8μg)的western blot结果显示,相较于阴性对照组,KD1组ALR蛋白的表达水平(0.51±0.02,0.36±0.09)、KD2组ALR蛋白的表达水平(0.65±0.04,0.49±0.02)、KD3组ALR蛋白的表达水平(0.62±0.07,0.52±0.02)均降低(P均<0.05),而以KD1组蛋白表达量最低。结论成功筛选并构建了能有效沉默ALR基因的最佳RNAi重组慢病毒载体,为后续实验奠定基础。

摘要：《中华肝脏病杂志》2018年刊出论文222篇,各级基金资助论文占50.5%。核心影响因子继续位居消化病学类期刊第一位,继续荣获"百种中国杰出学术期刊"称号,并获得2018年中国科学技术协会中文科技期刊精品建设计划项目资助。组织协办的"全国肝脏疾病临床学术大会暨国际肝病学会日"及"慢性病毒性肝炎抗病毒治疗难点和热点学术会议"分别于2018年5月和11月召开。2019年将继续办好杂志、办好会议。恪守"求真创新,追求卓越"的办刊理念,初心不改,倾力打造精品学术期刊。

摘要：目的 构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗原的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSuper-C,观察其对HepG2 2.2.15细胞(简称2.2.15细胞)中HBV DNA转录和翻译相应蛋白的影响。 方法 根据RNA干扰(RNAi)作用原理设计针对HBV核心区的相应序列,再将其克隆人含聚合酶ⅢH 1-RNA启动子的真核表达载体pSuper,将此重组质粒以电转染法转入2.2.1 5细胞中,用酶联免疫吸附法(Abbott试剂)检测培养上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表达。 结果 经酶切鉴定、电泳和测序分析证明,成功构建了含作用序列的重组质粒pSuper-C;但以电穿孔法转染2.2.15细胞后未能发现其对2.2.15细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg的表达有影响。 结论 RNAi在2.2.1 5细胞中的作用还需进一步的实验来证实。

摘要：目的 用RNA干扰技术,分别以转化生长因子（TGF）β 1、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1和TIMP-2为靶基因,设计并构建针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并在体外检测其对大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）的TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因表达的抑制情况.方法 设计合成TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2的siRNA并与含绿色荧光蛋白的pGenesil-1载体连接,构建siRNA真核表达载体,并测序鉴定.体外转染HSC-T6细胞,观察转染效率,并用荧光定量PCR以及Western blot分析对目的 基因的抑制效率.组间比较用方差分析,两两比较用q检验.结果 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体.体外成功转染HSC-T6细胞,转染后的细胞TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达分别下调63.4%±8.0%,64.5%±9.0%,55.0%±17.0%（F值分别为17.55、128.42、210.36,P值均＜0.01）,TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2蛋白表达分别下降57.8%±3.0%,55.1%±5.0%,49.3%±1.0%（F值分别为130.75、159.09、35.72,P值均＜0.01）.结论 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体;将重组载体成功转染入体外培养的HSC-T6细胞,并显著抑制了目的 基因的表达;为进一步研究其在体抑制表达提供了实验工具.

摘要：目的筛选并合成CIT基因的最佳siRNA干扰序列,并检测其对人肝癌细胞株SK-Hep-1中CIT基因表达的干扰效率及其对SK-Hep-1人肝癌细胞增殖的影响。方法根据CIT基因序列设计并合成3个siRNA靶点,通过脂质体转染法转染入SK-Hep-1人肝癌细胞,用Real-timePCR和蛋白质印迹法检测其对目的基因CIT的敲减效率。采用细胞免疫化学、共聚焦显微镜观察siRNA干扰后48h,SK-Hep-1细胞中CIT表达的变化情况。用EdU细胞增殖实验检测siRNA干扰后48h对SK-Hep-1细胞增殖的影响。两样本均数间比较采用t检验,多样本均数间比较采用单因素方差分析。结果3条针对不同靶点的干扰序列,蛋白质印迹法检测结果显示,相较于对照组,敲低1、2、3组CIT蛋白的表达水平均降低(P<0.01),而敲低1组蛋白表达量最低。Real-timePCR检测结果显示,相较于对照组,敲低1、2、3组CITmRNA表达水平均降低(P<0.01),而敲低1组mRNA表达量最低。激光共聚焦显微镜从形态学上也证实转染siRNA之后,CIT的表达明显减弱。EdU增殖实验结果显示,转染CIT的siRNA将明显减弱SK-Hep-1肝癌细胞的增殖(P<0.05)。结论成功筛选并合成能有效抑制SK-Hep-1肝癌细胞中CIT基因表达的siRNA片段,且能明显抑制SK-Hep-1细胞的增殖。

摘要：构建靶向乙肝病毒(HBV)X基因的真核表达载体pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,转染肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15,筛选和验证高效siRNA。设计4个靶向X基因siRNA,将siRNA和HBx基因插入载体pSOS得重组质粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA经PacI酶切去除目的片段HBx后得pSOS-siRNA。将质粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分别转HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株。荧光显微镜下观察HepG2细胞绿色荧光(GFP)减弱程度预估干扰效率。ELISA检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达,Western blotting检测胞内蛋白HBsAg、HBcAg表达,Real time PCR检测胞内HBsmRNA、HBx mRNA的转录。转染4d后,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的9%,预测其干扰效果最强。siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4d上清的HBsAg蛋白表达为对照的(13.92±1.14)%(P<0.05)、HBeAg为(21.69±4.92)%(P<0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.175±0.025、0.0825±0.028,均为各处理组中最低(P<0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分别降为对照的0.237±0.028(P<0.01)、0.110±0.022(P<0.01),差异有统计学意义,证实siRNA4为高效干扰位点。利用pSOS成功筛选并验证构建靶向HBV X基因的siRNA靶点。

摘要：背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响。本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克隆抗体阻断人肝癌细胞株HepG2表达,探讨hALR对细胞增殖的影响。方法:设计、构建siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B。将构建的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以计算转染效率。转染48h后,免疫细胞化学及RT-PCR法检测HepG2细胞中hALR的表达。用3H-TdR掺入法检测hALR的siRNA和特异性单克隆抗体对HepG2细胞增殖的影响。结果:HepG2细胞中有hALR的表达。成功构建了针对hALR基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A。转染入细胞后发现,pSIALR-A能明显抑制hALR的表达(mRNA的表达量减少83%),而随机序列的siRNA却无此作用。hALR的siRNA在体外能显著抑制人肝癌细胞株HepG2增殖,分别转染质粒pSIALR-A和pSIALR-B后HepG2细胞的cpm值为67687±6548和104807±5713(P<0.05)。抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后,可部分抑制肿瘤细胞自主性生长(P<0.05)。结论:HepG2细胞高表达hALR;针对hALR的siRNA能显著、特异性地抑制hALR表达,进而抑制HepG2细胞的生长。抗hALR单克隆抗体也能部分抑制HepG2细胞自主性生长。

摘要：本研究旨在借助毕赤酵母的表达和免疫特点,设计一种新型抗HBV治疗性疫苗,探索一种全新的可有效活化机体抗乙型肝炎病毒细胞免疫应答的方式。