摘要：目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化入大肠杆菌*** BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础。方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质粒PET-28a-GRA1,转化*** BL21,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:克隆的GRA1基因与GenBank收录的基因序列同源性为100%。对重组质粒进行酶切和PCR鉴定,获得573bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-GRA1。SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白条带的相对分子质量约为24 000,Western blotting显示重组蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论:成功获取GRA1基因,构建了PET-28a-GRA1重组质粒并获得了高效表达。

摘要：目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用。方法以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA1重组真核表达质粒,并将其转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达;用pVAX1-GRA1真核表达质粒注射免疫小鼠,通过检测血清特异IgG水平及血CD4+、CD8+细胞百分率并观察弓形虫感染小鼠的存活时间,评价其免疫保护力。结果 PCR扩增出573bp的GRA1开放阅读框,成功构建重组表达质粒pVAX1-GRA1。用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,Western blot证实该蛋白具有反应原性,SDS-PAGE检测该蛋白分子质量单位为24ku。用构建的核酸疫苗免疫小鼠,随着免疫次数的增加血清特异性IgG抗体滴度逐渐增加,CD4+与CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。弓形虫RH速殖子攻击感染疫苗免疫组小鼠存活时间为(165±23.1)d,PBS对照组、pVAX1对照组分别为(144±16.3)d和(148±16.3)d,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVAX1-GRA1有一定的免疫保护性,为弓形虫基因疫苗的进一步研究奠定了基础。