摘要：目的:探索人干扰素α1b喷雾剂制剂处方中抑菌剂及其最低有效抑菌浓度,确定抑菌剂的合理添加剂量。方法:应用生物学活性检测方法进行人干扰素α1b喷雾剂制剂处方中抑菌剂的筛选,确定抑菌剂,然后按照2020年版《中华人民共和国药典》通则1121抑菌效力检查法测定抑菌效力确定抑菌剂的最低有效抑菌浓度。以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉为试验菌株,进行菌落计数方法适用性试验。设计抑菌剂剂量筛选试验,对不同浓度的抑菌剂分别对4种试验菌的抑菌效果进行考察,筛选出抑菌剂的合理添加量。结果:筛选出人干扰素α1b喷雾剂制剂处方中的抑菌剂为苯扎溴铵;苯扎溴铵浓度为0.05~0.1 mg·mL^(-1)时对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的抑菌效力均符合A级。结论:确定了人干扰素α1b喷雾剂制剂处方中抑菌剂苯扎溴铵的最低有效抑菌浓度为0.05 mg·mL^(-1)。

摘要：良好工程实践(Good Engineering Practice,GEP)是以保证产品质量、患者安全、药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice of Medical Products,GMP)为目的,专用于制药工程项目的实践。本文基于长春生物制品研究所有限责任公司(简称长春所)现有管理体系及生物制药工程与国际工程项目管理模式,结合GEP技术特点,从用户需求(User Requirement Specification,URS)、计划、设计、变更、质量、移交等关键控制点入手,总结长春所GEP体系建设及其在狂犬病疫苗工程项目中的应用,为疫苗工程项目在风险管理、组织和控制、成本管理及创新和持续改进方面提供技术支持与理论依据。

摘要：目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计,通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化,找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果,其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为:上样量15 mg/mL,流速120 cm/h,洗脱液pH 7.0~8.0,洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg,在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件,为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。

摘要：目的原核表达、纯化蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1),并评价其在蜱传脑炎(tick-borne encephalitis,TBE)临床诊断中的应用价值。方法根据GenBank登录的TBEV“森张”株NS1基因序列设计引物,PCR扩增TBEV NS1基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经GST bestarose 4FF亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以重组NS1蛋白为固相抗原,采用间接ELISA法检测临床血清。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约65000,表达量为22.1%,主要以包涵体形式存在;纯化蛋白纯度达93%以上,与TBEV全病毒感染小鼠血清具有良好的反应原性。采用NS1作为包被抗原的间接ELISA法检测临床血清,特异性为95%,敏感度为100%。结论成功在大肠埃希菌中表达并纯化了TBEV NS1蛋白;作为病毒特异性抗原,经间接ELISA法验证,该蛋白在临床疾病的血清学诊断上具有一定的应用价值。

摘要：目的对重组戊型肝炎疫苗（recombinant hepatitis E virus,rHEV）抗原P179表征进行分析。方法取3批HPLC及电泳纯度均为100%的rHEV抗原P179原液,采用SDS-PAGE法检测相对分子质量及二聚体含量;OPA-FMOC全自动柱前衍生-Amino Quant氨基酸分析法测定氨基酸组分;电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱（electrospray ionizationquadrupole time-of-flight-mass spectrometry,ESI-Q-TOF2-MS）法分析C-末端、Edman降解法测定N-末端氨基酸序列;HPLC法进行肽图分析;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;圆二色光谱仪分析其二级结构;透射电镜负染法观察蛋白颗粒状态;双抗体夹心ELISA法检测抗原活性。结果 3批rHEV抗原P179相对分子质量在17 500-21 300之间;二聚体占总蛋白的85%以上;氨基酸组分、C-末端氨基酸序列、N-末端氨基酸序列、肽图、等电点等均与预期相符;3批rHEV抗原P179二级结构中,α螺旋4.8%-5.6%,β折叠34.8%-36.4%,β转角20.8%-22.2%及无规卷曲37.7%-38.0%;透射电镜观察可见大小均一,粒径约20 nm的蛋白颗粒;抗原活性比值在5.0×10^5-2.0×10^6CCU/mg范围内。结论 3批r HEV抗原P179结构特征均一,与设计相符,为该疫苗的产业化奠定了基础。

摘要：目的构建载药明胶微球缓释系统,并分析其体外缓释效果。方法以成球率、微球粒径均匀度、不黏连率为考察指标,正交设计优化明胶微球缓释系统的制备工艺,并以干扰素α2b(IFNα2b)为模型药物制备干扰素明胶缓释微球,通过载药试验确认其载药工艺后进行体外缓释效果观察。结果构建的载药明胶微球缓释系统成球率为(92.58±1.18)%,微球粒径均匀度为(82±0.2)%,不黏连率为(4.67±1.15)%;每克干扰素明胶缓释微球最佳载药剂量为每克微球4×10~6 IU,可在体外缓释64 h。结论载药明胶微球缓释系统制备工艺稳定,操作简便,产品体外缓释效果良好,可在缓释剂型领域广泛应用。

摘要：目的比较并评价3~8岁及9岁以上人群中,接种流感病毒裂解疫苗后的安全性及免疫原性。方法采用单中心无对照设计,在湖北省汉川市选择600名≥3岁受试对象,按3~8岁、≥9岁分为两组,比较两组受试者接种流感病毒裂解疫苗后的安全性及免疫原性。结果3~8岁组H1N1、H3N2和B型流感病毒HI抗体阳转率分别为73.9%、68.1%和72.5%,≥9岁组分别为70.4%、89.2%和63.4%,3~8岁组H3N2型流感病毒抗体阳转率明显低于≥9岁组,差异有统计学意义(P0.05);与免疫前比较,3~8岁组流感病毒HI抗体GMT增长倍数分别为11.4、9.1和14.5,≥9岁组分别为10.5、22.5和6.6,两组间差异无统计学意义(P>0.05);3~8岁组免疫后抗体保护率分别为88.4%、100.0%和94.2%,≥9岁组分别为98.9%、100.0%和96.6%,≥9岁组H1N1型流感病毒抗体保护率明显高于3~8岁组,差异有统计学意义(P0.05);总不良反应发生率3~8岁组为5.8%,≥9岁组为5.2%。结论流感病毒裂解疫苗在≥3岁人群中接种1剂,≥9岁组某些型别免疫效果优于3~8岁组。本研究为3~8岁儿童免疫新程序设计提供参考。

摘要：目的对森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)森"张"株在Vero细胞上的适应株(以下称SZV株)进行全基因组测序,并与TBEV远东亚型的其他毒株、欧洲亚型毒株进行比较。方法设计TBEV的特异性引物,提取SZV株病毒总RNA,以其为模板,采用RT-PCR方法分段扩增序列并测序,应用Vector NTI 9.0软件进行拼接,并与森"张"株、Gen Bank中报道的TBEV远东亚型Oshima 5-10株、Sofjin-HO株及欧洲亚型263株、Neudoerfl株的全长基因序列进行比对分析。结果 SZV株的全基因组由10 782个核苷酸组成,仅编码1个开放阅读框,长度为10 245个核苷酸,共编码3 414个氨基酸。SZV株与TBEV远东亚型的Oshima5-10株和Sofjin-HO株ORF区编码的氨基酸序列同源性分别为95.0%和94.6%,与TBEV欧洲亚型的典型毒株263株和Neudoerfl株ORF区编码的氨基酸序列同源性分别为91.1%和91.0%。结论对TBEV Vero细胞适应株SZV进行了全基因组序列测定及分析,为研制基于Vero细胞基质的森林脑炎疫苗奠定了基础。

摘要：目的制备重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒,并进行验证。方法选用中国食品药品检定研究院(简称中检院)制备的羊抗S蛋白多克隆抗体作为包被抗体,从4株单克隆抗体(14C8、15F9、17A7和20D8)中筛选出1株具有受体结合域(receptor-binding domain,RBD)结合活性高,且广谱抗主要突变株的单克隆抗体作为酶标抗体(用HRP标记),制备重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA法通用检测试剂盒,并采用棋盘滴定法对包被抗体稀释度(1∶125~1∶4000)和酶标抗体稀释度(1∶250~1∶32000)进行优化。验证试剂盒的专属性、线性范围、准确性、精密性及耐用性。将制备的通用检测试剂盒分发给12个实验室,检测各实验室自制的不同表达系统(CHO细胞、毕赤酵母、Sf9细胞或大肠埃希菌)和目的蛋白(RBD或S蛋白)的15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液(包括11批以WT株为参考序列设计的原液及4批以Beta、Gamma和Delta变异株设计的原液)。结果确定包被抗体最佳稀释度为1∶500,单克隆抗体20D8作为酶标抗体,最佳稀释度为1∶4000。通用检测试剂盒与严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)病毒的重组S蛋白无交叉反应;第1代重组SARS-CoV-2蛋白疫苗抗原国家标准品(简称国家标准品)浓度在0.16~2.50 U/mL范围内,与A450/630呈良好的线性关系,线性方程为:y=0.791 x-0.1004,R2=0.9937;0.16~2.50 U/mL国家标准品重复6次检测结果回收率均在95%~104%之间,变异系数(coefficient of variation,CV)均<15%;2名实验员在不同时间重复3次检测结果的CV为4.4%~6.6%;在不同温度及时间条件下检测结果回收率均在80%~120%范围内。15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液抗原含量的检测结果与国家标准品均具有良好的平行性。结论本研究建立的抗原含量通用检测试剂盒具有良好的专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于重组SARSCoV-2蛋白疫苗抗原含量的检测。

摘要：目的构建蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)衣壳蛋白(capsid protein,C)原核表达质粒,并以其表达、纯化的C蛋白作为抗原检测临床血清,评价其在蜱传脑炎(tick-borne encephalitis,TBE)临床血清学诊断中的应用。方法登录Genbank对TBEV“森张”株C蛋白基因序列设计扩增引物,以PCR扩增C蛋白目的基因并克隆至原核表达载体pET-32a(+)后,构建重组表达质粒pET-32a-C。再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导剂诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以制备的C蛋白作为包被抗原,用间接ELISA分别检测20份TBEV IgG抗体阳性临床血清、10份流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)阳性临床血清及20份阴性血清,并计算检测的特异性和敏感度。结果重组表达质粒pET-32a-C序列测定正确;经12%SDS-PAGE电泳分析,重组C蛋白主要为可溶性蛋白表达;纯化后蛋白纯度>90%,经Western blot鉴定可与TBEV全病毒血清抗体特异性结合。间接ELISA定性检测临床TBE血清,其特异性与敏感度分别为96.7%和95.0%。结论成功构建了TBEV衣壳蛋白重组表达质粒pET-32a-C并在大肠埃希菌中实现诱导表达;表达的重组C蛋白可与TBEV阳性血清特异性结合,在临床疾病的血清学诊断上具有一定的应用价值。