摘要：目的观察针对乙型肝炎病毒(HBV)X区设计的siRNA表达载体pGenesil-HBVX对HepG2.2.15细胞相应蛋白表达的影响。方法筛选出最佳转染效率的剂量配比,将阳离子脂质体METAFECTENE与pGen-esil-HBVX的复合物转染HepG2.2.15细胞,于转染后24、48、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)。结果具有最佳转染效率而且不显著影响细胞活性的剂量配比为8μl∶2.5μg。pGenesil-HBVX转染HepG2.2.15细胞后24h,细胞上清液中HBsAg、HBeAg含量尚无显著变化(P>0.05);48h后HBsAg、HBeAg表达均有明显下降(P<0.01),并且持续至72h。结论pGenesil-HBVX可以在获得一定转染效率的基础上有效抑制HepG2.2.15细胞中HBV的表达。

摘要：目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定。方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性。结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2。酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达。结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体。

摘要：目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对Fas的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)串联表达的栽体．方法:设计表达2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析．分别用SacI+ SalI双酶切重组质粒,胶回收酶切pEGFP6- 1-siFas1大片段和酶切pGenesil-1-siFas2小片段,T4 DNA Ligase连接酶切大、小片段,得到pEGFP6-1-siFas1+siFas2重组质粒．转化感受态细胞DH5α,扩增,提取串联重组质粒进行酶切鉴定．结果:成功构建靶向Fas的2个shRNA串联重组质粒载体pEGFP6-1-siFas1+siFas2．酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功．结论:表达2个靶向Fas的shRNA表达框成功构建在一个重组质粒载体上．

摘要：目的研究针对HBVX基因区设计的小干扰RNA(siRNA)表达载体质粒pGenesil-siHBVX对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法针对HBVX区设计siRNA表达载体质粒pGenesil-siHBVX。分别用培养液(空白对照)、脂质体Metafectene、pGenesil空载体、pGenesil-siHK(阴性对照)、pGenesil-siAFP(特异性对照)、pGenesil-siHBVX处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24h,取各组细胞培养上清液,用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量,用化学发光法检测AFP含量,用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。结果pGenesil-siHBVX转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达,且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后,pGenesil-siHBVX组细胞上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为(6.26±1.07)ng/ml、(0.13±0.05)Ncu/ml和(3.01±0.40)×107拷贝/ml,与空白对照组的(22.50±1.39)ng/ml、(1.12±0.11)Ncu/ml和(12.33±1.28)×107拷贝/ml比较,差异有统计学意义(t值分别为12.80、12.21、9.71,P<0.05);pGenesil-siHBVX转染不影响细胞对AFP的表达(t=0.18,P=0.86)。结论pGenesil-siHBVX可以有效和特异地抑制HepG2.2.15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。

摘要：目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA(short hairpinRNA,shRNA)串联表达的载体pEGFP6-1-siFas1+siFas2,进一步通过BDAdeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体。方法:设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,酶切pEGFP6-1-siFas1大片段和酶切pGenesil-1-siFas2小片段,经T4DNALigase连接得到pEGFP6-1-siFas1+siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pShuttle2穿梭质粒,经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFas1+siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态***5а,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno-siFas1+siFas2质粒,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果:构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确;经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白。结论:成功构建Fas-shRNA腺病毒串联表达载体。