摘要：目的:克隆幽门螺杆菌(Hp) hp0169基因并进行晶体学研究,分析其二级结构和三维结构。方法:由UniProt数据库中检索Hp NCTC26695菌株hp0169基因及其编码蛋白序列,采用生物信息学方法分析Hp重组胶原蛋白酶(HpPrtC)蛋白理化性质,SOPMA和DNAStrar软件预测HpPrtC蛋白二级结构特征,SWISS-MOPEL软件构建HpPrtC蛋白三维结构,IEDB和ABCpred软件预测HpPrtC蛋白B淋巴细胞抗原表位,SYFPEITHI网站预测T淋巴细胞抗原表位,专家库(EP)算法和随机森林(RF)算法预测HpPrtC蛋白可结晶性。原核表达HpPrtC重组蛋白,经Ni^(2+)亲和层析和分子筛技术纯化蛋白,结晶试剂盒筛选HpPrtC的结晶条件。结果:hp0169基因共包含1 269个碱基配对,编码蛋白全长422个氨基酸,理论等电点为7.64,相对分子质量为47 300。HpPrtC蛋白为亲水性、可溶性蛋白。HpPrtC蛋白α螺旋的氨基酸数量占全部氨基酸数量百分率为35.78%,β片层为18.72%,β转角为6.87%,无规则卷曲为38.63%。抗原表位分析,HpPrtC蛋白含有B淋巴细胞的5个优势线性表位和3个构象表位及多个T淋巴细胞潜在优势抗原表位。同源建模,HpPrtC蛋白呈二聚体,单体由β折叠围成桶状结构,周围被α螺旋和无规则卷曲围绕。HpPrtC蛋白为中等难度结晶,且无信号肽和跨膜螺旋,在0.2 mol·L^(-1)氯化镁、 0.1 mol·L^(-1)三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3.4 mol·L^(-1)己二醇和pH 8.5条件下出现细小成簇的针状晶体。结论:HpPrtC是一种亲水型蛋白,呈二聚体构造,在适宜条件下呈细小成簇针状晶体,其具有T淋巴细胞和B淋巴细胞优势抗原表位,可作为Hp疫苗设计的抗原,用于构建多价融合疫苗或多表位疫苗,本研究结果为Hp的防治提供了实验基础。

摘要：目的探究蛋白激酶9 (PK9)在约氏疟原虫生长发育中的作用。方法基于疟原虫PlasmoDB数据库,查找约氏疟原虫致死株17XL (Py17XL)的PK9序列信息, BLAST比对Py PK9和恶性疟原虫PK9(Pf PK9)以及人蛋白激酶p78的同源性。提取Py17XL株野生型(WT)基因组DNA,设计引物, PCR扩增PK9基因。采用CRISPR-Cas9技术,将同源臂与sgRNA序列一起连接到PYC-MCS质粒中,构建PK9基因敲除(PK9KO)重组质粒。重组质粒电转至Py17XL虫株内,经乙胺嘧啶筛选、克隆,进行PCR鉴定和测序。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT感染组和PK9KO感染组,每组5只,重复3次实验。每鼠腹腔注射1×105个红内期疟原虫,每隔24 h取血检测小鼠原虫血症,观察小鼠存活情况。200只3~5日龄的斯氏按蚊随机分为WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组,每组100只。于吸血8 d后解剖蚊胃,每组随机选取15只斯氏按蚊进行解剖,测定蚊胃中卵囊的数量。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组,每组5只,重复2次实验。每鼠尾静脉注射1×103个子孢子,每隔12 h取血,涂片观察其原虫血症出现时间。结果Py PK9与Pf PK9的序列一致性为82.5%, Py PK9和人类蛋白激酶p78的一致性为39.4%。PK9基因PCR扩增产物的长度约为597 bp。经PCR鉴定、测序确定PK9KO重组质粒构建成功, Py17XL虫株成功敲除PK9基因。WT感染组小鼠迅速出现原虫血症,感染后5~6 d全部死亡, PK9KO感染组小鼠全部存活,原虫血症在感染后17 d消失。WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组的斯氏按蚊感染率分别为60.0%(9/15)和66.7%(10/15),差异无统计学意义(P> 0.05)。WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组小鼠均于72 h查见原虫血症。结论PK9在红内期Py17XL的毒力中发挥了重要作用。