摘要：目的 探讨HIV-1 Tat对人脑内皮细胞基质金属蛋白-9（MMP-9）的影响及作用机制。方法 按照Weksler＇s方法分离和处理人脑血管内皮细胞。小分子干扰RNA（siRNA）沉寂MMP-9,根据报告的序列设计MMP-9的特异性siRNA和Scramble II对照,MMP-9的活性采用明胶酶谱法检测,进行内皮细胞渗透性检测。结果 实验结果显示,Tat增强MMP-9的表达和活性,siRNA靶向作用于MMP-9以减少可溶性闭锁蛋白的浓度,Tat可以使HBMECs渗透性显著增强。MMP-9干扰可以恢复Tat处理后细胞的完整性。结论 Tat可以抑制闭锁蛋白的表达,并通过增强MMP的表达和激活而间接破坏闭锁蛋白,使血脑屏障（BBB）渗透性增强。

摘要：目的优化PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体以增加SOD融合蛋白表达。方法通过基因工程设计引物并优化PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,扩增并鉴定目的基因,将优化后的原核重组表达载体以热激法转化至***21(DE3)中,通过IPTG诱导重组载体进行蛋白表达,通过溶菌酶+超声裂解菌体,离心后收集上清,利用Ni-NTA树脂纯化,10 kD,20k D透析袋浓缩,以获得SOD融合蛋白。利用SDS-PAGE凝胶电泳及Westernblot鉴定SOD融合蛋白。采用BCA与黄嘌呤氧化酶法测定SOD融合蛋白浓度及活力。结果优化后的重组表达载体优化了稀有碱基,增加了His·Tag标签,His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD序列作为一个整体,在Nco I与Bam H I限制性内切酶作用下定向插入,构建了长度为6213bp的优化质粒,基因测序结果与预先设计的序列对比显示碱基序列正确。优化后的SOD融合蛋白表达量约占菌体的32%,较前(20%)提高,纯化浓缩后纯度为94%,较前(90%)增加。测定浓度为1.8 mg/ml,37℃时SOD总活力为(3065.137±19.75)U/mg prot。结论通过重组表达载体密码子优化,可以获得高产量、高活性的SOD融合蛋白。

摘要：目的构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中检测其启动活性。方法设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆获得hTERT启动子,用双酶切和PCR法切除笔者所在课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp中的CEA启动子后,将hTERT启动子与该载体重组,构建出pLEGFP-5HRE-hTERTp;提取5HRE-hTERTp基因序列,同时双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体中的CMV启动子,同源重组构建获得pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体。设计引物应用PCR法从笔者所在课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体中克隆获得CDX2基因序列,用双酶切和PCR法切除载体pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG中的EGFP后,将CDX2基因序列与该载体重组,构建出pLVX-5HREhTERTp-CDX2-3FLAG。应用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达,鉴定hTERTp的启动活性。结果经PCR和测序分析,pLEGFP-5HREhTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG 3组质粒与设计一致,测序正确。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,有绿色荧光表达,提示hTERT启动子能够有效启动下游基因的表达。结论成功构建了pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体,为后续的体外和体内研究打下了基础。