摘要：目的:设计对比实验,以冷冻草莓为材料,研究样品中所含抑制剂对诺如病毒荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测结果的影响,优化提高检测灵敏度与准确率。方法:GⅡ型诺如病毒便悬液的制备与RNA提取,已知阴性冷冻草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA提取纯化,分组(对照组、实验组),抑制剂去除,荧光定量RT-PCR检测。结果:随着病毒浓度的梯度递减,抑制剂影响作用呈明显增强趋势,导致在高于正常检测最低限度两个数量级的水平,即出现假阴性结果;抑制剂去除的实验组检测结果,随着病毒浓度梯度的递减明显优于未经处理的对照组;抑制剂去除的实验组稳定检出限为10-6(Ct值小于40),最低检出限为10-7(诺如病毒(norovirus,No V)浓度梯度检测最低检出限为10-5)。结论:抑制剂去除可明显优化冷冻草莓中No V荧光定量RT-PCR检测,提高检测方法的灵敏度,且操作简便快捷,检测成本浮动不大,期望应用于日常检测工作中。

摘要：本研究使用恒温环介导技术,以空肠弯曲菌的促旋酶基因A(gyrA)设计引物,建立空肠弯曲菌的LAMP快速检测方法。不同来源的4株空肠弯曲菌LAMP检测均显示阳性,其他14种细菌LAMP检测显示阴性。实验结果表明,设计的引物具有良好的特异性。本研究进行了LAMP检测方法与细菌平板计数法和PCR法的灵敏度比较,结果LAMP检测与PCR法有相近的灵敏度,比细菌平板计数法灵敏度高3个数量级。我们还研究发现提取核酸前加入DNase可以有效地减少死菌DNA对LAMP结果的影响。使用LAMP方法对鸡法氏囊的检测表明,结合核酸提取步骤中的DNase处理步骤,可以准确的检测出鸡法氏囊中的空肠弯曲菌。

摘要：以柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋白基因(登录号:AE008923.1)为靶标,设计并筛选4条引物来特异性识别靶标序列中的6个独立区域,建立柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法。该方法利用实时浊度仪检测反应过程中产生的焦磷酸镁白色沉淀,实现对LAMP整个反应过程的实时监控。从镁离子浓度、甜菜碱浓度、d NTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数对LAMP检测体系进行优化,并对方法的特异性、灵敏度、稳定性及实际样品检测效果进行评价。结果显示,该体系经优化后稳定性良好,可在66℃恒温条件下,60 min内完成检测;DNA检测下限可达0.02 ng/μL,灵敏度与荧光定量PCR方法相同,比常规PCR方法高1个数量级;能快速、准确地对田间疑似样品进行检测,与荧光定量PCR方法的检出情况一致,没有漏检。结果说明柑橘溃疡病菌实时浊度LAMP检测方法操作简便、所需时间短,特异性与灵敏度高,为柑橘溃疡病菌的快速筛查提供较好的途径。

摘要：将环介导的等温核酸扩增技术应用于转基因大豆及加工品检测。针对抗草甘膦Roundup Ready转基因大豆及加工品外源基因EPSPS设计2对特异性引物进行扩增,成功建立起定性检测转基因大豆及加工品的LAMP检测方法。优化LAMP反应条件,反应温度为65℃,反应时间为1h。结果表明:该体系能快速、灵敏、有效地检测转基因大豆及加工品中整合的EPSPS基因,检测限为0.01%,低于国际现行最低检测量0.5%的要求。检测EPSPS基因操作简单,成本低、特异性强、灵敏度高。LAMP检测结果可信,稳定性好,可对目前批准的抗草甘膦RoundupReady转基因大豆及加工品进行定性检测。

摘要：建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。

摘要：本文把一种新型荧光染料——Eva Green应用在荧光PCR中,通过设计特异性的引物来检测转基因产品。所检测的转基因基因包括内对照基因rbcl,外源基因的筛选基因Carny 35S启动子,NOS终止子,NPTⅡ基因,外源基因的鉴定转基因大豆roundupready的CP4CP4EPSPS和转基因马铃薯NEWLEAF的PVYcp。实验结果表明,各对引物特异性强,使用EvaGreen荧光检测的结果稳定,检测线可以小于0．5％．

摘要：根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用PrimerExplorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化。与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应。将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15 fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级。该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的牙鲆样品中都含有淋巴囊肿病毒,而10尾外观正常牙鲆鱼苗则没有检测到淋巴囊肿病毒(与预期结果一致),说明LAMP方法比较适合淋巴囊肿病毒的早期及现场诊断。

摘要：根据《关于危险货物运输的建议书》对危险品的分类方法分析了第4.1类易燃固体危险品的特点和危险性,研制了易燃固体类危险品试验仪,给出其硬件组成和软件设计逻辑梯形图。通过对乌洛托品及硫磺等危险品的实际分类试验,证实该试验仪检测分类准确、操作安全,具有较高的可溯源性。

摘要：根据滚环扩增的原理设计引物、锁式探针以及反应体系,建立和优化了滚环扩增(Rolling Cycle Amplification,RCA)检测体系,构建可快速检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌的RCA检测方法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立的RCA检测方法,具有很好的特异性,灵敏度为1.7×102CFU/mL,高于普通PCR方法。小肠结肠炎耶尔森氏菌RCA检测方法具有较高的灵敏度和特异性,适合在细菌快速检测方面应用。

摘要：目的:建立实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法:针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果:建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。