摘要：目的:探讨利用干扰RNA(RNAi)抑制血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法:设计针对VEGF基因的小干扰RNA(siRNA),合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGFmRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果:所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论:体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

摘要：为探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)对树突状细胞(dendritic cell,DC)功能及其分化的影响,针对VEGF基因设计siRNA(small interferingRNA,siRNA),采用脂质体转染法以100nmol/L最佳转染浓度导入MCF-7乳腺癌细胞(siRNA组),以脂质体Lipofectamine2000TM转染MCF-7乳腺癌细胞培养上清培养正常DC作为对照(对照组),采用ELISA法检测经siRNA干扰VEGF基因后的MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF因子含量,Western印迹检测VEGF蛋白表达,以探讨siRNA的基因沉默效果;以siRNA组和对照组培养上清分别培养外周血单个核细胞,用流式细胞仪检测所诱导DC表型CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,用MTT法检测转染前后两组DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)对MCF-7细胞的细胞毒作用.结果显示,MCF-7乳腺癌细胞培养上清能明显抑制正常DC分化成熟及抗原递呈能力,干扰VEGF基因后MCF-7乳腺癌细胞培养上清对DC的影响明显降低,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达较对照组显著升高,而CD1a表达下降(P<0.01).转染前后DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤活性有明显差异(P<0.01).由此可见,siRNA可靶向抑制MCF-7乳腺癌细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7细胞上清对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低,从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用.

摘要：RNA干涉(RNA interference,RNAi)是指序列特异性的转录后基因沉默,它已经发展成为高效、特异阻断目的基因表达的有效工具。据此,我们针对人VEGF165基因mRNA序列,设计了2个干涉靶位点,体外转录合成siRNA,通过脂质体转染入HeLa细胞,分别体内、体外观察对HeLa细胞凋亡的影响。[第一段]

摘要：目的:研究siRNA(small interfering RNA)对人胃腺癌细胞SGC-7901的VEGF基因表达的影响．方法:选择血管内皮生长因子(VEGF)基因为靶基因,设计两组针对VEGF mRNA的小干扰RNA,合成DNA寡核苷酸链,体外转录合成siRNA．以人胃腺癌细胞系SGC-7901为靶细胞,应用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞．采用Hoechst33258染色观察siRNA作用于SGC-7901细胞中出现凋亡小体的情况．流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT-PCR法比较转染前后VEGF mRNA表达水平的变化, ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化．结果:两组siRNA转染后均能有效地抑制 SGC-7901细胞的生长,诱导细胞凋亡产生凋亡小体．siRNA作用于SGC-7901细胞．其细胞周期均发生了明显的变化,主要表现为G0／G1 期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0／G1期(siRNA1组,siRNA2组G0／G1期VS 对照组G0／G1期:75．04％,76．52％ vs 58．37％, P<0．01;siRNA1组,siRNA2组S期vs对照组S 期:17．82％,16．73％ vs 39．52％,P<0．01),而其他组则无明显变化．VEGF mRNA的表达量大幅度减少(siRNA1组,siRNA2组vs对照组: 0．638±0．078,0．656±0．085 vs 0．941±0．046, P<0．01),相对应的VEGF蛋白水平也显著降低(164．7±22．7,166．3±26．6 vs 414．0±61．5, P<0．01),而其他组siRNA转染后则无上述作用．结论:应用靶向VEGF基因RNA干扰技术可以有效抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖．

摘要：背景:硫酸软骨素是细胞基质的重要成分,可促进肿瘤细胞的增殖,抑制其转移。目的:观察硫酸软骨素对阿霉素作用下HL60细胞增殖分化的影响。设计:开放性实验。单位:青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室。材料:实验于2003-09/2004-12在青岛大学医学院生物化学与分子生物学研究室完成。HL60细胞株购于中国医学科学院上海细胞库,为人类早幼粒白血病细胞。牛软骨硫酸软骨素(Sigma)。方法:①细胞传代培养后将进入对数增殖期的细胞用含体积分数0.1灭活胎牛血清的RPMI1640培养液配制成1×108L-1的细胞悬液,分装于45个培养瓶中,4mL/瓶。②取分装好的细胞悬液15瓶,按照0,5,25,50,75mg/L浓度加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。采取细胞计数法测定硫酸软骨素处理后的HL60细胞密度的变化。③取分装好的细胞悬液30瓶,分为硫酸软骨素+阿霉素组、硫酸软骨素组,各15瓶。按照0,5,25,50,75mg/L浓度向两组加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mmol/L磷酸盐缓冲液。用MTT法测定硫酸软骨素处理后的HL60细胞加入阿霉素后细胞存活率的变化。④取分装好的细胞悬液15瓶,按照0,5,25,50,75mg/L浓度加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。用酶联免疫反应测定各组细胞的酸性磷酸酶活性,观察其对细胞分化的影响。主要观察指标:①硫酸软骨素对HL60细胞增殖的影响。②硫酸软骨素+阿霉素对HL60细胞存活率的影响。③硫酸软骨素对HL60细胞酸性磷酸酶活性的影响。结果:共制备细胞悬液45瓶,全部进入结果分析。①与空白对照组比较,不同浓度硫酸软骨素处理24h后HL60细胞密度均显著升高(P0.05),说明在这个浓度范围内硫酸软骨素对细胞生长的促进作用变化不大。②与空白对照组比较,加入不同浓度硫酸软骨素后,硫酸软骨素+阿霉素组细胞存活率均有不同程度的降低,硫酸软骨素浓度超过25mg/L时降低明显(P<0.01)。③与空白对照组比较,5,25,50mg/L硫酸软骨素浓度组HL60细胞酸性磷酸酶吸光度值均明显升高(1.268±0.038,1.305±0.101,1.321±0.021,1.354±0.013,P<0.01或0.05),尤其是75mg/L硫酸软骨素浓度组HL60细胞酸性磷酸酶吸光度值高达1.406±0.113,与空白对照组比较差异有极显著意义(P<0.001)。结论:硫酸软骨素在适当浓度时对HL60细胞的增殖产生促进作用,可提高HL60细胞对阿霉素的敏感性,促进细胞分化。

摘要：背景:随着国内人民生活水平的不断提高,大肠癌的发生率不断提高。大量的流行病学调查表明,膳食因素与大肠癌的高发有着密切的相关性。目的:通过建立大鼠大肠癌的动物模型,观察膳食纤维与肌醇六磷酸(植酸)对大肠癌发生的作用。设计:随机区组设计。单位:青岛大学医学院营养学研究所。材料:实验于2004-03/12在青岛大学医学院营养学研究所进行。将86只4周龄雄性Wistar大鼠按体质量随机区组分为纤维素组(14只)、果胶组(14只)、植酸组(15只)、纤维素+植酸组(14只)、果胶+植酸组(14只)和对照组(15只)6组。方法:对照组:无膳食纤维的基础饲料;果胶组:添加10%的果胶;纤维素组:添加10%的纤维素;植酸组:添加2%的植酸钠饮水;果胶+植酸组:添加10%的果胶和2%的植酸钠饮水;纤维素+植酸组:添加10%的纤维素和2%的植酸钠饮水。对86只大鼠用1,2-二甲肼皮下注射诱发大肠癌,观察大鼠大肠肿瘤的发生率、肿瘤的数量及体积;测定大鼠大肠粘膜细胞的增殖活性(增殖细胞核抗原阳性细胞数/计数的细胞核总数)。主要观察指标:①各组大鼠大肠肿瘤的发生率,平均每只鼠的肿瘤个数和肿瘤体积变化。②大鼠大肠黏膜细胞的增殖活性。结果:①各组大鼠多死于喂养20周前。果胶组、果胶+植酸组及对照组各有1只大鼠死于喂养20周后。②各组大鼠大肠肿瘤的发生率与对照组相比差异无显著性(P>0.05),但植酸组平均每只鼠的肿瘤个数和肿瘤体积显著低于对照组数量:(1.1±0.2),(4.1±1.2)个/只,P<0.01;体积:(176.1±65.5),(1046.7±469.0)mm3,P<0.05,果胶组、果胶+植酸组平均每只鼠的肿瘤个数显著高于对照组(7.5±1.9),(7.2±1.0)个/只,P<0.05。③植酸组大鼠大肠黏膜细胞的增殖活性比对照组显著降低,果胶组大鼠大肠黏膜细胞的增殖活性比对照组升高(41.8±4.7)%,(83.6±2.9)%,(66.7±7.8)%,P<0.01和0.05。结论:膳食中添加果胶能增加诱癌大鼠患大肠肿瘤的危险,而饮水中添加2%的植酸可降低诱癌大鼠患大肠肿瘤的危险。

摘要：目的:利用siRNA(small interference RNA)技术研究c-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法:依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对c-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet- SITM-ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA-scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT-PCR法比较转染前后c-myc mRNA表达水平的变化。结果:细胞计数法结果显示,转染24 h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48 h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论:体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。

摘要：目的:利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞VEGF165基因表达,探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:设计针对VEGF165基因的小干扰RNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA(small interfering RNA),采用lipofectamine2000转染人宫颈癌HeLa细胞。通过Hoechst33258染色、流式细胞术、RT-PCR检测人宫颈癌HeLa细胞体外凋亡情况。在体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将VEGF siRNA直接注入瘤体,观察siRNA对肿瘤生长的影响,蛋白印迹试验检测VEGF siRNA在体内条件下对VEGF、bcl-2蛋白表达的影响。结果:所设计的两个siRNA均能有效诱导细胞凋亡产生凋亡小体,并使细胞周期阻滞于G0/G1期;VEGF165和bcl-2在mRNA及蛋白水平的表达也受到有效抑制,明显减少。结论:针对人VEGF165基因体外转录合成的siRNA在体内外均可诱导HeLa细胞发生凋亡。

摘要：目的:研究针对VEGF基因的siRNA(small interference RNA)对乳腺癌MCF-7细胞细胞周期的影响。方法:依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对VEGF基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。脂质体转染法将合成的siRNA转染入MCF-7细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNAscr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期变化,RT-PCR法比较转染前后p21、CyclinD1表达水平的变化,Westernblot检测转染前后磷酸化ERK的表达。结果:细胞计数法结果显示,转染24h后siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。siRNA转染后能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,S期细胞明显减少,G0/G1期细胞比例逐渐增多;p21mRNA表达显著上调,抑制Cyclin D1 mRNA及磷酸化ERK蛋白的表达。结论:体外转录合成的siRNA可能通过上调细胞周期蛋白激酶抑制剂p21的表达,下调Cyclin D1及磷酸化ERK的表达,将细胞周期阻滞于G0/G1期,从而显著抑制MCF-7细胞的增殖。

摘要：目的研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的影响。方法利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VEGF mRNA的siRNA,通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC-7901细胞,设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照,用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化,ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长,并使细胞周期阻滞于G0/G1期;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低,作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达。