摘要：根据羊痘病毒(CaPV)P32和ITR基因序列,设计合成了2对引物,建立了不同基因片段检测羊痘病毒核酸的PCR方法。结果表明针对2种基因的PCR方法敏感性较高,最小DNA检出量分别为20.15 ng(P32)和25.80 pg(ITR);扩增禽痘疫苗毒株、羊口疮病毒细胞培养物、口蹄疫病毒细胞培养物,结果均为阴性,特异性较强。扩增产物进行序列分析,与GenBank收录的其他株病毒P32核苷酸同源性为99.5%～99.9%,与ITR基因同源性为98.3%～100%。本方法为羊痘的快速诊断提供了可靠、简便的检测技术。

摘要：为建立一种快速诊断猪肺炎支原体病原的方法,根据GenBank上登录的Mhp基因组序列,在保守区基因内部设计合成2对引物,经过PCR反应条件的优化,建立了检测猪肺炎支原体的巢式PCR方法。结果表明,该方法对鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;第1次扩增的敏感性是10pg,第2次扩增的敏感性是0.1pg,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。巢式PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以在短时间内准确快速的检测出低含量的Mhp病原,为猪肺炎支原体的快速诊断与净化奠定基础。

摘要：为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine vi-ral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。

摘要：为了分析食源性大肠杆菌flic基因的遗传变异特点,利用生物性软件设计大肠杆菌flic基因特异性引物,采用PCR技术扩增flic基因,扩增产物纯化后测定核苷酸序列,通过生物软件分析测定的序列结果表明,所测大肠杆菌分离株flic基因的核苷酸序列与参考大肠杆菌H511菌株、E49菌株的flic基因分别存在1个和22个核苷酸的差异,核苷酸序列同源性分别为99.9%、98.4%。

摘要：建立多重PCR诊断方法。以复活羊败血性链球菌病活疫苗作为研究对象,根据细菌16S rRNA基因通用引物和羊败血性链球菌种属特异性sodA基因,参考文献设计合成引物并进行PCR扩增。结果显示:(1)疫苗株接种BHI增菌培养,细菌生长缓慢,24 h后BHI培养基变浑浊;在血平板上形成有光泽、透明湿润、黏稠,表面光滑、边缘整齐,露滴状细小、灰白色的菌落,菌落周围有明显的β溶血。(2)羊败血性链球菌病疫苗株细菌镜检结果显示,镜检可见呈革兰氏染色阳性,常成对或3~5个短链排列的球形或椭圆形球菌,有荚膜。(3)羊败血性链球菌病疫苗株核酸提取结果显示,提取核酸稳定性良好,可用于后续实验研究。(4)PCR扩增结果显示,该方法特异性和敏感性好,可为羊败血性链球菌病的实验室诊断检测和分子流行病学调查提供技术支撑。研究认为,多重PCR检测方法简便、快捷,敏感性和特异性良好,技术易掌握,普遍适合基层单位使用,可快速获得诊断结果,确定病原,为临床合理用药提供科学依据。

摘要：为了检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Dazl基因mRNA表达水平。利用GenBank中牛Dazl mRNA序列,在其保守区设计并合成特异性引物,以牛肌动蛋白基因(β-actin)为内参,建立实时荧光定量PCR方法。结果表明,在100～10-6 7个拷贝量重组质粒稀释范围内,Dazl和β-actin基因的Ct值与重组质粒的含量均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.999。熔解曲线产物为特异的单峰,具有较高的灵敏度和特异性。Dazl基因重组质粒最小检出含量达到10拷贝/μL,批内变异系数保持在1.351%以内,批间变异系数保持在3.217%以内,重复性较好。Dazl基因的mRNA表达量在犏牛睾丸组织中最低,这一分布可能与犏牛精子发生过程中减数分裂调控作用相关。

摘要：为快速诊断犊牦牛大肠埃希菌感染情况,本研究从100份腹泻犊牦牛粪便中分离致病性大肠埃希菌,根据已发表的致病性大肠埃希菌外膜蛋白紧密素eae基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了牦牛源致病性大肠埃希菌PCR检测方法,并经实验验证该方法特异性及敏感性均较好,检测下限为3.6×10^(2) cfu/mL。

摘要：为探讨羊流产嗜性衣原体MOMP蛋白的生物学功能、揭示其在流产衣原体病诊断和防治中的作用。本试验根据Gen Bank公布的流产嗜性衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因序列,设计并合成4条特异性引物,以羊流产嗜性衣原体青海分离株感染的鸡胚卵黄囊中提取的衣原体基因组为模板,应用套式PCR扩增到MOMP全基因序列。通过生物信息学软件对该基因的结构及其推导的氨基酸序列进行了预测分析,同时分析了与其他流产嗜性衣原体的同源性。结果显示,该基因全长1 170 bp,可编码389个氨基酸,蛋白分子量理论值为41.8 ku,理论等电点7.54,编码蛋白理化性质较稳定。其第1位到第19位氨基酸残基为信号肽序列,具有3处N-糖基化位点。含有多个能被其他酶修饰的位点,以无规则卷曲为主,含5个跨膜区,3个亲水性较强的抗原表位。同源性分析表明与其他流产嗜性衣原体分离株的一致性高在93%以上,系统进化分析表明与OCLH196株(序列号为AJ440239)位于同一进化分支。

摘要：为构建青海血蜱Haemalin基因的cDNA全长序列,并分析该基因的生物信息学特征及其在青海血蜱不同发育阶段和雌蜱不同组织中的转录水平,本研究基于青海血蜱唾液腺转录组文库中检索到的一个功能注释为Haemalin的基因片段,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)引物设计软件设计Haemalin基因3'RACE和5'RACE特异性引物,分别经RACE扩增青海血蜱Haemalin基因的3'端和5'端序列,测序后与其中间序列拼接获得该基因的cDNA全长序列。利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的信号肽、理化性质、跨膜结构域、结构域、蛋白质三级结构、B细胞抗原表位以及氨基酸序列比对,采用NCBI中的BLAST及MEGA 7.0软件分别分析Haemalin基因编码氨基酸序列的相似性及构建其系统进化树,采用qPCR检测Haemalin基因在不同发育阶段青海血蜱和雌蜱不同组织中的转录水平。结果显示,青海血蜱Haemalin基因cDNA全长583 bp,开放阅读框(ORF)423 bp,该基因编码蛋白的信号肽为N端的15个氨基酸,理论等电点4.71,属于亲水性蛋白,无跨膜结构域。该基因编码蛋白的三级结构分析结果显示,其存在两个典型的Kunitz/牛胰蛋白酶抑制剂(Kunitz/BPTI)结构域,两个结构域之间由单链连接,共包括3个α螺旋,2对反向平行的β折叠;在aa35~aa45、aa54~aa60、aa75~aa80、aa91~aa93、aa125~aa131等处可能存在潜在的B细胞抗原表位。相似性与进化树结果显示,青海血蜱Haemalin氨基酸序列与褐黄血蜱凝血酶抑制剂Haemalin氨基酸序列的相似最高达92%,并在进化树中二者处于同一进化分支。表明,青海血蜱Haemalin可能也为一种凝血酶抑制剂。qPCR结果显示,Haemalin基因在不同发育阶段青海血蜱中的转录水平为:卵>半饱血蜱>若蜱>饱血蜱>幼蜱>吸血96 h的雌成蜱>游离雌成蜱,且其在青海血蜱雌蜱中肠中的转录水平极显著高于其他组织(P<0.0001)。表明,Haemalin基因在青海血蜱成蜱吸血阶段及其在该蜱的血液消化中均发挥重要作用。本研究为进一步研究Haemalin基因的生物学功能及其在青海血蜱防控中的作用奠定基础。

摘要：为建立一种快速、准确的动物衣原体检测方法,本研究基于动物衣原体的保守基因env B的序列,设计并合成引物与探针,建立了一种动物衣原体特异性重组酶聚合酶扩增（RPA）检测方法。该检测方法在37-39℃恒温反应20 min,即可实现对动物衣原体目的基因片段的有效扩增,并具有高灵敏度的特点,最低检测限为101copies/L,同时利用建立的RPA检测方法和普通PCR方法 对10份临床样品进行衣原体检测,结果阳性检出率完全一致。表明,本研究建立的动物衣原体RPA检测方法操作简单方便、灵敏度高,短时间内能获得准确可靠的诊断结果,对动物衣原体的临床检测和疾病诊断提供了一种新的、可靠的技术支持。