摘要：目的应用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats,CRISPR)基因分型方法,对乌兰县分离鼠疫菌株进行CRISPR基因分型分析,以了解该地区鼠疫菌CRISPR类群和基因型。方法复苏培养乌兰县1966—2010年取自鼠疫患者、媒介昆虫和喜马拉雅旱獭的63株原始鼠疫菌株,提取其DNA,设计CRISPR的YPa、YPb、YPc 3个位点引物,利用PCR技术,对以上位点进行扩增,测定其扩增产物核酸序列并进行综合分析,将测得的CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary和美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库进行比对,探索是否存在之前未出现的CRISPR间隔(spacer)类群和基因型别,分析菌株间可能的进化关系,最终确定乌兰县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地鼠疫菌菌株的CRISPR基因库。结果63株鼠疫菌在3个CRISPR位点上共有16种spacer,其中YPa位点9种、YPb位点4种、YPc位点3种。63株鼠疫菌可被分为6个基因型,分别为G26-a1′、G26-a1′a4^(-)、G22-a4^(-)、G22、G22-a1′a4^(-)、G7,归为4大CRISPR类群,分别为Ca35′、Ca7、Ca7′、Cb4。Ca35′是该地区主要流行类群;Ca7和Ca7′分布在乌兰县东部的铜普镇和茶卡镇;Cb4仅存在于赛什克地区。结论青海省乌兰县鼠疫菌种群结构相对稳定,以Ca35′为主要种群,G26-a1′型为主要基因型,呈现显著的地区聚集特征,今后可以利用CRISPR基因分型技术加强该地区鼠疫溯源检测和防控工作。

摘要：目的了解青海省青南地区rpsL基因点突变引起鼠疫菌耐链霉素的现状,为今后青南地区突发人间鼠疫的精准临床用药及预防耐药发生提供理论依据。方法筛选1957—2009年青海省青南地区取自鼠疫患者、媒介昆虫体内及中间宿主的104株代表性鼠疫菌,用赫氏平皿进行分离培养,采用十二烷基磺酸钠裂解和苯酚-氯仿法提取代表性鼠疫菌的DNA,针对我国链霉素耐药基因rpsL基因设计引物及TaqMan-小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针Probe1[FAM]和Probe2[VIC],利用TaqMan-MGB荧光探针的实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,对青南地区104株鼠疫菌链霉素耐药位点rpsL基因的突变情况进行检测。结果青南地区104株被试菌株FAM检测结果均为阳性,对应检测rpsL(128:A),相对荧光单位(relative fluorescence unit,RFU)峰值>1000,阴性1000。即青南地区104株鼠疫菌中未发现耐链霉素rpsL基因点突变菌株。结论了解到青南地区鼠疫菌耐链霉素菌株分布情况,为青南地区预防耐药发生以及鼠疫菌临床治疗提供了基础数据。

摘要：目的研究青海省海南藏族自治州(海南州)鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)对链霉素的敏感性,以便在突发鼠疫疫情中能精准地指导鼠疫临床用药。方法根据鼠疫菌基因序列设计特异性引物,以S19960127菌株核糖体蛋白S12编码基因(rpsL基因)突变位点和野生型鼠疫菌株rpsL基因位点分别设计探针,利用TaqMan-MGB探针技术对海南州1954-2009年分离的87株鼠疫菌进行耐链霉素rpsL基因突变位点检测。结果87株被试菌株的野生型A碱基的羧基荧光素(FAM)探针检测结果均为阳性,每个反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(Ct)值在18.74~21.93,相对荧光单位(RFU)峰值>2000;S19960127的Ct值为25.42,RFU峰值1000;阴性对照RFU峰值<200。实验结果显示海南州鼠疫疫源地87株鼠疫菌基因序列第128位的碱基未发生A→G突变,该疫源地未检出耐链霉素鼠疫菌株。结论海南州鼠疫疫源地87株鼠疫菌对链霉素均敏感。鉴于细菌耐药性基因的产生与传播特征,应持续开展监测并建立鼠疫菌耐药性监测网络,以便能及时发现并控制耐药菌的传播。

摘要：目的了解青海省玉树藏族自治州(简称玉树州)鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)的基因分型,探讨其遗传特征。方法选取1963-2007年分离自玉树州鼠疫自然疫源地的44株代表性鼠疫菌,提取DNA,针对CRISPR的3个位点(YPa、YPb和YPc)设计引物,进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序及分析,鉴定CRISPR间区序列(spacer),确定CRISPR基因型和类群。结果44株鼠疫菌在CRISPR 3个位点上共有23种spacer,YPa位点14种、YPb位点6种、YPc位点3种,其中有2种新spacer,a106和a107。根据spacer阵列形式,44株鼠疫菌被分为15个CRISPR基因型、6个CRISPR类群,6个类群分别为Cb4、Cc3′、Ca7、Ca7′、Ca△5′和Ca35′,其中Ca7为主要流行类群(34株)。结论玉树州鼠疫菌CRISPR位点具有多种基因型,遗传多态性较高,种群结构复杂。

摘要：目的 应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术快速检测青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐链霉素基因,为今后该地区突发人间鼠疫的精准临床用药提供理论依据。方法 分离培养海西地区1957—2009年间取自鼠疫患者、媒介昆虫及中间宿主的代表性鼠疫菌110株,提取其DNA,针对我国链霉素耐药基因rpsl基因设计引物P-F和P-R和TaqMan-MGB探针Probe1 [FAM]和Probe2[VIC],利用荧光定量PCR技术,进行耐药rpsl基因筛查。结果 110株被试菌株中FAM检测均为阳性(RFU峰值>2000);VIC阳性的为0株(RFU峰值<200)。阳性对照和空白对照成立。结论 实时荧光定量PCR结果显示,该地区未检测出耐链霉素菌株。

摘要：目的利用聚合酶链式反应（PCR）技术，建立鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）多种耐药基因的检测方法，为鼠疫的治疗提供指导性建议。方法根据美国国立生物信息中心（NCBI）公布的耐氨基糖苷类链霉素strA、strB基因、耐β-内酰胺类抗菌药物tem、shv、ctx-m基因，耐磺胺类药物sul1、sul2、sul3基因序列，分别对每个基因设计1对引物，对282株分离自青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照后读取结果。对282株菌株进行链霉素、磺胺甲恶唑、头孢曲松钠3种药物的耐药性检测。结果282株菌株的PCR扩增结果均为阴性，尚未发现具有链霉素、磺胺类药及β-内酰胺类抗菌药抗药基因的菌株。药敏试验显示，282株菌株对链霉素、磺胺甲恶唑、头孢曲松钠均高度敏感。抑菌环直径分别〉 19、17、21 mm。结论利用PCR技术作为鼠疫菌多种耐药基因的检测方法是可行的，应用该方法能系统监测大批量鼠疫菌的耐药基因是高效、经济、实用的实验方法，能为鼠疫治疗提供指导性建议。

摘要：目的对青海省果洛藏族自治州(果洛州)鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行病原学分析及耐药相关基因检测,为该地区的鼠疫防治提供科学依据。方法对1978-2016年间青海省果洛州分离的13株鼠疫菌进行糖醇类酵解试验、毒力测定、毒力因子检测、质粒分析及鼠疫菌基因差异区段(DFR)分型等研究,并根据美国国立生物信息中心(NCBI)公布的耐氨基糖苷类链霉素strA、strB基因、耐β-内酰胺类抗菌药物tem、ctx-m基因和耐磺胺类药物sul1、sul2基因序列,在每个基因上设计1对引物,以该13株鼠疫菌DNA为模板分别进行上述6个耐药基因的PCR扩增,以检测其是否携带耐药相关基因。结果根据生化分型指标,13株被试菌株中9株为青藏高原型,4株为祁连山型。毒力测定结果显示,13株被试菌株均为强毒级别的鼠疫菌,13株菌中有11株具备鼠疫菌特有的4个毒力因子,被试菌株携带相对分子质量分别为6×106、45×106、65×106和6×106、45×106、52×106的2种质粒谱。DFR分为4个基因组型,5型(7株)、8型(4株)、36型和01b型(各1株)。耐药基因检测结果显示,阴性对照和阳性对照均成立的情况下,所测13株鼠疫菌的PCR检测结果均为阴性,未发现耐链霉素、耐β-内酰胺类抗菌药物及耐磺胺类药物的菌株。结论青海省果洛州分离的鼠疫菌具备青藏高原鼠疫病原体特征,鼠疫菌的毒力强,但尚未出现耐抗菌药物菌株,但仍需加强鼠疫监测和鼠疫防治知识宣传力度,严防动物间鼠疫波及人间。