摘要：目的探索一种适用于临床标本检测的肺炎支原体套式PCR．P1一RFLP基因分型方法并对其应用进行评价。方法参考肺炎支原体标准株P1基因RepMp4及RepMp2／3序列，分别在两个序列内部设计4条内套引物，采用文献报道的外套引物及新设计内套引物进行套式PCR扩增，扩增产物混合后用HaeⅢ酶切，根据不同的酶切图谱结果判断其型别，同时采用测序验证；对标准株DNA及临床标本DNA倍比稀释后进行检测，验证新改良方法敏感性；收集2012年肺炎支原体感染阳性标本，采用研究新改良的方法进行分型检测并与现有方法进行比较。结果经测序验证，以套式PCR为基础的P1-RFLP基因分型方法能够对临床标本进行很好的扩增；与现有的分型方法相比，新改良方法敏感性提高10^3倍，差异有统计学意义；北京地区2012年儿科肺炎支原体流行基因型为I型。结论套式PCR—P1-RFLP基因分型方法敏感性高，能够对临床标本进行很好的扩增。

摘要：细胞培养中支原体污染已经成为严重的问题。为了扩增６种支原体（精氨酸支原体，口腔支原体，人型支原体，猪鼻支原体，发酵支原体及莱氏支原体）核糖体ＲＮＡ操纵子的１６ｓ和２３ｓＤＮＡ间区，设计了三个通用ＰＣＲ引物（Ｆ１，Ｆ２及Ｒ１）．当以６种支原体ＤＮＡ为模板时，引物Ｆ１和Ｒ１产生３４０到４６８ｂｐ的片段，引物Ｆ２和Ｒ１产生１４５到２１１ｂｐ的片段，当用Ｈｅｌａ细胞或Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ作为模板，用引物Ｆ１和Ｒ１时，在电泳中未观察到特定区带。此法最小能检出８．５ｆｇ精氨酸支原体ＤＮＡ，相当于１３个精氨酸支原体。这说明，当这些支原体污染细胞培养时，能用ＰＣＲ法检测出来。

摘要：目的建立儿童呼吸道5种易感病原菌多重PCR(Multiplex PCR,mPCR)检测方法,并应用该方法分析北京地区儿童呼吸道易感病原菌菌群分布情况。方法分别设计针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)自溶素基因(ply)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,KP)16S核糖体RNA基因(16S rRNA)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)热核酸酶基因(nuc)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)特异性保守基因(SeS)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,HI)16S rRNA基因的特异性引物,建立mPCR检测方法;验证该方法的特异性及敏感性;并采用该方法对北京地区128例呼吸道感染患儿和80名健康儿童咽拭子或痰标本进行检测,并与传统培养法检测结果进行比对。结果 mPCR法能对同一样品中5种病原菌的DNA模板同时进行PCR扩增;该方法检测5种病原菌之间及与呼吸道其他易感病原之间无交叉反应,敏感性可达5×10-10μg/μl;mPCR法检测128例呼吸道感染患儿的菌群分布情况为:HI 24.22%、SP 15.63%、KP 4.69%,SA 2.34%,未检出SE,与培养法相比,两种检测方法的总符合率为78.91%;感染患儿与健康儿童相比,HI和SP的感染率差异有统计学意义(P<0.01)。结论建立了从呼吸道标本中直接检测多病原儿童易感病原菌的mPCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高,为临床正确诊断和治疗细菌感染性疾病提供了参考。

摘要：目的建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法。方法设计靶向猴痘病毒F3L基因的特异性引物和探针,建立猴痘病毒核酸的ddPCR检测方法,对ddPCR的最适反应条件进行优化,并对ddPCR的特异性、灵敏度以及重复性进行检测。进一步对人脓拭子临床样本进行检测,对ddPCR方法检测临床样本的能力进行评价。结果对ddPCR反应温度和引物探针浓度进行优化,建立猴痘病毒ddPCR检测方法,该方法最低检测限可达2拷贝/μl,与其他8种病毒无交叉反应。对10份人皮肤脓液拭子临床样本中的猴痘病毒进行检测,ddPCR方法检测到5份阳性样本,实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法检测到4份阳性样本。结论建立的猴痘病毒的ddPCR检测方法快速、特异、灵敏度高,用于临床样本中猴痘病毒检测。

摘要：实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR）是根据荧光共振能量转移原理,设计相应的荧光标记核酸探针,通过PCR反应对靶DNA进行定性、定量测定的技术[1],可根据样品的循环阈值,参照标准曲线准确计算出样本内核酸的起始浓度,实现PCR从定性到定量的飞跃。

摘要：目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核酸进行检测,对RT-PCR方法检测临床样本能力进行评价。结果本研究建立的RT-PCR检测方法可实现猴痘病毒的特异性检测,与天花、痘苗、牛痘等其他正痘病毒无交叉反应,检测重复性好,最低检测限为103copies/μL。可以对人皮肤拭子样本中的猴痘病毒进行准确检测。结论本研究建立了猴痘病毒的RT-PCR检测方法,可在临床样本中快速、特异、灵敏的检测猴痘病毒。

摘要：目的监测分析2011年夏季北京地区儿童腹泻主要病原菌,为该地区儿童腹泻病原的快速诊断与防治提供依据。方法收集2011年夏季在该院感染消化科就诊的腹泻患儿粪便标本,提取粪便标本DNA,设计特异性引物建立PCR方法对易导致儿童腹泻的最常见的3种病原菌进行检测,部分阳性结果测序验证,并与以往腹泻病原菌监测结果进行比较分析。结果在259例腹泻患儿中,总病原菌的检出率为69%,其中致腹泻型大肠杆菌属检出率为64%,志贺菌属检出率为15%,沙门菌属检出率为4.2%;男女儿童致病菌检出率、各年龄组间和急慢性腹泻天数比较差异均无统计学意义。本监测结果显示,致腹泻型大肠杆菌属是目前北京市引起儿童夏季腹泻的主要病原菌,其次为志贺菌属。结论 (1)2011年夏季北京地区引起儿童腹泻的主要肠道病原菌种类发生了明显的变化,以致腹泻性大肠杆菌属为主。(2)该研究建立的快速PCR法可检测多种儿童腹泻易感病原菌。

摘要：目的利用逆转录-环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立快速检测委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)的方法。方法针对VEEV nsp1基因序列,设计了5套特异性引物进行筛选,再对反应温度进行优化,最后进行特异性、灵敏性及重复性评价。结果RT-LAMP检测VEEV的最适温度在65℃;同时选取11种病毒进行RT-LAMP,证明了RT-LAMP具有高特异性;运用RT-qPCR与RT-LAMP对比灵敏性,结果表现为RT-LAMP检测的灵敏性超RT-qPCR检测的100倍。针对VEEV进行RT-LAMP的重复性实验,结果为具有较好的重复性。结论RT-LAMP检测VEEV法具有简单快速高效的特点,且装置简单,特异性强、灵敏性高、重复性好。