摘要：目的采用自行设计的引物,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立一种快速检测急性呼吸道感染患儿咽拭子标本中肺炎支原体的方法。方法针对肺炎支原体基因组内存在的重复序列SDC1设计6条特异性LAMP引物(SMP),使用实时浊度仪进行扩增反应并记录结果。对该方法进行灵敏度和特异性检测,并与文献报道的引物(JMP)进行比较。应用该方法和实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测55例儿童咽拭子标本并对结果进行比较。结果本研究中设计的肺炎支原体特异性SMP引物灵敏度高,最低检出肺炎支原体标准株FH的DNA拷贝数为6个。采用SMP引物的LAMP方法特异性好,与其他支原体和细菌间无交叉反应。55例临床标本分别使用SMP引物和JMP引物进行LAMP检测,两种方法的总符合率为98.2%;使用SMP引物的LAMP方法与Q-PCR的总符合率为96.4%。结论采用本研究设计的SMP引物所建立的LAMP方法灵敏度更高,特异性好,较Q-PCR操作简便,耗时短,可用于临床儿童咽拭子标本中肺炎支原体的实验室快速检测,具有良好的临床应用前景。

摘要：目的建立检测肺炎支原体的荧光定量PCR法,并与市售试剂盒和传统巢式PCR法的检测性能进行比较。方法设计针对肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征毒素基因的特异性引物,构建含相应目的片段的质粒作为标准品,采用SYBR Green染料法进行实时定量PCR,并绘制标准曲线。通过检测其他细菌和170例儿童临床咽拭子样本,比较新建荧光定量PCR法、市售试剂盒和传统巢式PCR法在临床应用中的差异。结果新建荧光定量PCR法和巢式PCR法能够检出的肺炎支原体标准株DNA最低模板量为10拷贝,市售试剂盒检出最低模板量为102拷贝。在特异性实验中3种方法均可区分肺炎支原体和其他菌种。在检测的170例儿童临床咽试子样本中,新建荧光定量PCR法、市售试剂盒和传统巢式PCR法的阳性率分别为60.00%、50.00%和53.53%。新建荧光定量PCR法与市售试剂盒的结果具有高度相关性(r=0.953),2种方法的总符合率为86%,Kappa值为0.729。新建荧光定量PCR法与传统巢式PCR法的结果总符合率为90%,Kappa值为0.797。结论新建荧光定量PCR法与市售试剂盒相比灵敏性更高,特异性相同,成本低;与传统巢式PCR法相比操作简单,耗时短且污染少,具有良好的科研和临床应用前景。

摘要：目的 建立荧光定量PCR检验卡他莫拉杆菌的实验室诊断方法并检验临床样本.方法 针对卡他莫拉杆菌外膜蛋白COPB设计引物及探针;构建含卡他莫拉杆菌目的基因片段的质粒,梯度稀释后作为标准品,绘制标准曲线;验证实验方法的敏感性;通过检测7种病原体标准株验证该方法的特异性.用新建荧光定量PCR检测321例诊断为哮喘的儿童患者咽拭子标本.结果 绘制新建荧光定量PCRTaqman探针法检测质粒标准品的标准曲线,新建实验室诊断方法的敏感性可达10拷贝/反应,研究方法可成功区分卡他莫拉杆菌与其他6种病原体DNA.检测321例临床咽拭子样本,卡他莫拉杆菌阳性25例,阳性检出率为7.79%.结论 新建荧光定量PCR法具有较高的灵敏度、特异性,能简单、快速、准确、灵敏地检测卡他莫拉杆菌,可以应用于临床样本的检测.

摘要：目的利用实时定量PCR技术（SYBR Green染料法）建立一种快速、特异、敏感、经济、准确检测肺炎支原体的方法，并评价其在临床上的应用价值。方法选择肺炎支原体的23S rRNA耐药相关基因作为扩增区，设计特异性引物，然后提取相应质粒作为标准品，建立绝对定量的标准曲线。比较荧光定量PCR方法与传统巢式PCR方法和市售试剂盒的特异度和灵敏度；分别利用上述三种方法和培养法检测临床咽拭子样本，进行相关系数、符合率及kappa系数的分析。结果实时定量PCR和巢式PCR检测肺炎支原体的灵敏度为10拷贝；市售试剂盒为10^2拷贝。特异性检验中，肺炎支原体样本检测为阳性，人型支原体和其他4种细菌均检测为阴性。临床样本检测中，实时定量PCR、巢式PCR、市售试剂盒和培养法的阳性率分别为55．49％、52．75％．47．25％和39．0l％。统计学分析结果显示，新建实时定量PCR与传统巢式PCR的结果总符合率为89．6％，Kappa系数为0．790。实时定量PCR方法与市售试剂盒检测结果的相关系数R=0．923，P〈0．001；两种方法的总符合率为89．6％，Kappa系数为0．792。实时定量PCR与培养法的结果总符合率为83．5％，Kappa系数为0．678。结论采用实时定量PCR方法检测肺炎支原体与其它几种方法相比，快速经济，且污染少，特异性强，灵敏度高，具有很重要的科研和临床实用价值。