摘要：目的设计和评价微测序基因芯片检测结核分枝杆菌(MTB)耐药性的价值。方法于北京结核病临床数据和样本资源库选取MTB实验室标准菌株(H37Rv)和109株MTB临床分离株,采用绝对浓度法进行表型药物敏感性试验(简称“表型药敏试验”)和基因测序法检测MTB耐药相关基因突变(包括inhA、katG、rpsL、gyrA、rrs、eis、rpoB和embB基因)。以荧光标记探针为基本检测原理设计制备微测序基因芯片,检测109株MTB临床分离株耐药基因突变,分析微测序基因芯片的检测效能。结果通过表型药敏试验及基因测序检测,明确了109株MTB临床分离株耐药相关基因(inhA、katG、rpsL、gyrA、rrs、eis、rpoB和embB基因)突变位点及突变形式。微测序耐药检测基因芯片初期设计包含了katG、inhA、rpoB、gyrA、embB、rpsL、rrs和eis基因的目前已报道的所有突变位点的全部已知突变形式,共计220条探针,并确认出67条优秀探针。采用包含67条探针的微测序耐药检测基因芯片对109株MTB临床分离株进行检测。结果发现,与测序结果相比,除检测embB基因突变的2条探针外,其余65条探针检测碱基突变形式的符合率均超过95%,其中42条探针检测的符合率达到100.00%。以测序结果为参照标准,基因芯片检测对embB基因、gyrA基因、inhA基因、katG基因、rpoB基因、rpsL基因、eis基因和rrs基因突变检测的敏感度分别为64.21%(61/95)、80.00%(8/10)、95.83%(23/24)、98.55%(68/69)、92.63%(88/95)、93.85%(61/65)、75.00%(3/4)和94.44%(17/18);特异度分别为92.86%(13/14)、100.00%(99/99)、97.65%(83/85)、87.50%(35/40)、85.71%(12/14)、63.64%(28/44)、100.00%(105/105)和98.90%(90/91);Kappa值分别为0.29、0.88、0.92、0.88、0.68、0.60、0.85、0.93。结论本研究研发设计了一套包含67条探针微测序耐药基因检测芯片,经过初步验证后证明其检测MTB耐药相关基因突变的效能较好,对embB基因的耐药检测探针还需进一步优化,使之更好的满足临床需求。

摘要：目的评估探针熔解曲线法检测石蜡包埋组织诊断耐药结核病的临床价值。方法采用横断面研究设计,回顾性收集首都医科大学附属北京胸科医院2018年1月至2019年12月所有确诊结核病住院患者4551例。以表型药敏试验和GeneXpert结核分枝杆菌及利福平耐药(Xpert MTB/RIF,以下简称"Xpert")检测为金标准分析探针熔解曲线法的准确性,并评估该技术作为常规耐药诊断方法的补充,提高耐药结核病诊断阳性率的临床价值。结果以表型药敏试验结果为金标准,探针熔解曲线法检测利福平、异烟肼、乙胺丁醇和氟喹诺酮耐药的灵敏度分别为14/15、95.7%(22/23)、2/4、8/9;特异度分别为92.0%(115/125)、93.2%(109/117)、90.4%(123/136)、93.9%(123/131);总符合率为92.1%(95%CI:89.6%~94.1%),一致性检验Kappa值为0.63(95%CI:0.55~0.72),以Xpert检测结果为标准,该技术对利福平耐药检测的灵敏度为93.6%(44/47),特异度为100%(310/310),符合率为99.2%(95%CI:97.6%~99.7%),一致性检验Kappa值为0.96(95%CI:0.93~0.99);在4551例结核病确诊患者中联合应用探针熔解曲线法检测后,获得有效耐药信息的患者比例从83.3%提高到87.8%(P<0.01);利福平、异烟肼、乙胺丁醇、氟喹诺酮耐药、耐多药以及准广泛耐药检出人数分别增加了3.2%、14.7%、22.2%、13.7%、11.2%以及12.5%。结论探针熔解曲线法进行结核病耐药诊断具有良好的准确性,可以作为常规耐药诊断方法的补充,有效提高耐药结核病诊断阳性率。

摘要：目的研究原核类泛素（Pup）-蛋白酶体系统对分枝杆菌生长活力的影响。方法分别敲除耻垢分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统中pup和蛋白酶体β亚基基因（prcB）。选取待敲除基因的上下游侧翼序列设计引物，构建自杀性载体，靶基因同源序列和菌株基因组发生同源重组后获得基因敲除的菌株。分别连续测定野生型和基因敲除株在正常及低氧和厌氧应激培养条件下的吸光度值，比较菌株生长活力的变化。结果正确构建敲除pup和prcB基因的突变株，分别命名为△SM-Pup和△SM-prcB。△SM-Pup菌株生长速度快于野生型菌株和△SM—preB株。prcB基因的敲除对细菌的生长活力没有产生明显的影响。结论Pup-蛋白酶体系统对耻垢分枝杆菌的生长产生了一定作用，但具体机制仍需要进一步研究探讨。

摘要：目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-1crRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为101拷贝/μl的质粒和100拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于106拷贝/μl的MTB DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均=-9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。

摘要：目的 用基于多重PCR (multiplex PCR,mPCR)扩增子的二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术(mPCR-NGS)检测MTB的耐药基因突变,并评估其检测石蜡包埋组织标本诊断耐药结核病的临床应用价值.方法 选取北京市昌平区结核病防治所2013年4月至2015年10月常规进行了利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星和氧氟沙星比例法检测且具有药敏试验结果的50株MTB临床分离株,包括42株耐药MTB和8株敏感MTB菌株.参考耐药基因数据库及相关文献,针对以上8种抗结核药物主要耐药基因及常见位点设计耐药基因组合,建立有效的检测方案.收集首都医科大学附属北京胸科医院病理科2017年11月至2018年9月耐药结核病患者55例的石蜡包埋组织标本,探针熔解曲线法检测结果为利福平、异烟肼、乙胺丁醇和氟喹诺酮类至少存在一种耐药相关基因突变.首先对已知表型药敏试验结果的MTB临床分离株进行mPCR-NGS检测,验证该方法检测纯菌样本的有效性,再进一步检测结核病患者石蜡包埋组织标本进行临床验证.主要评价指标为敏感度和特异度以及一致性.结果 以比例法为金标准,mPCR-NGS检测利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的敏感度分别为95% (38/40)、93%(27/29)、93% (27/29)和72%(13/18),特异度分别为100%(10/10)、95% (20/21)、100%(21/21)和94%(30/32);二线注射类药物卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星敏感度均为100% (2/2,3/3,3/3),特异度分别为98%(47/48)、100%(33/33)和100%(47/47);氧氟沙星的敏感度为70%(7/10),特异度为100%(40/40).总符合率为94%,一致性检验Kappa值为0.87.纳入的55例石蜡包埋组织标本经探针熔解曲线法检测,28例利福平耐药,37例异烟肼耐药,13例乙胺丁醇耐药,17例氟喹诺酮类耐药.mPCR-NGS与探针熔解曲线法比较,利福平、异烟肼、乙胺丁醇和氟喹诺酮类的敏感度分别为100%(28/28)、95%(35/37)、100%(13/13)和100%(17/17);特异度均为100%(27/27,18/18,42/42,38/38).两种方法总符合率为99%,一致性检验Kappa值为0.98.结论 mPCR-NGS检测MTB临床分离株及结核病患者石蜡包埋组织标本耐药基因突变的敏感度、特异度和符合率较高,有望成为耐药结核病准确、快速的分子病理诊断新技术.

摘要：结核病(Tuberculosis,TB)是人类健康的主要威胁之一,多药组合的化学治疗是控制结核病的主要手段。近年贝达喹啉(Bedaquiline,BDQ)、德拉马尼(Delamanid,DLM)、普托马尼(Pretomanid,PMD)等抗耐药结核新药的出现,显著提高了耐药结核的治愈率。了解抗耐药结核新药的药动学特征及药物相互作用特点,合理设计药物组合及给药方案,可以减少药物不良反应发生,提高治疗成功率。本文对三种主要抗耐药结核新药的代谢动力学及药物相互作用研究进行综述,旨在为临床治疗提供依据和参考。

摘要：目的调查复治肺结核既往史信息,为国家制定和调整复治肺结核患者防治政策提供依据。方法使用统一设计的调查问卷,收集2010年9月11-21日期间在北京某两家结核病专科医院经所有住院的134例复治肺结核病患者相关信息,包括患者的基本信息、首次求医行为、首次诊断和治疗等内容并进行整理分析。结果与结核病专科医院等其他机构相比,首次就诊、确诊机构及治疗都是县级以上综合医院比例最高分别为55.22%(74/134)、61.19%(82/134)及53.73%(72/134),首次检查痰涂片检出率为63.43%(85/134);首次治疗个体化方案和标准化方案分别为92.53%(124/134)及7.47%(10/134);有28.36%(38/134)的患者在治疗期间中断治疗,55.26%(21/38)的患者治疗中断原因是自认为治愈而中断治疗;35.82%(48/134)的患者发生了不良反应,因不良反应中断治疗的患者为26.32%(10/38)。结论复治肺结核患者首次就诊转诊不到位,诊疗不规范,应加强多部分合作对转诊工作进行监督,规范诊疗,加强服药监督,提高患者治疗依从性,减少治疗中断,从而减少耐药及提高治愈率。

摘要：结核病疫情依然严峻,迫切需要抗结核新药。新药临床试验是新药研发的最重要阶段,早期杀菌活性(early bactericidal activity,EBA)研究是新型抗结核药物首次用于结核病患者治疗时进行的临床研究,也是单个抗结核药物和新的联合方案临床评价的关键。为了规范开展以及更好地推进我国抗结核新药研发进程,首都医科大学附属北京胸科医院和《中国防痨杂志》编辑委员会共同组织结核病临床研究和基础研究领域的专家,经反复讨论,撰写了《抗结核新药早期杀菌活性研究方法专家共识》,就抗结核新药EBA的意义、设计、实施,以及影响因素等内容进行阐述。

摘要：目的了解我国结核病相关医疗机构医师的受教育情况,比较单位和医师个人之间对于医师在职学习的认知和期望,分析限制医师参加学习深造的因素,为医疗机构创造更好的医师培养环境提供建议。方法于2018年10—12月,选取全国结核病医院联盟中41家结核病相关的医疗机构(包括综合性医院、专科医院及结核病防治机构)作为调查对象。设计两份问卷,分别针对医疗机构的教育主管人员和结核科医师进行问卷调查,调查内容包括单位基本情况、对医师受教育情况的满意度、单位的医师培养措施等。医疗机构层面调查共回收有效问卷41份,问卷有效率100.0%(41/41);结核科医师层面调查共回收有效问卷194份,问卷有效率100.0%(194/194)。比较单位和医师个人对于医师在职学习的倾向性、认知和期望情况。结果 12.2%(5/41)的医疗机构对医师的学历结构满意,在认为“研究生以上学历人员数量不足”的单位中,有70.8%(17/24)的单位招收医师的条件低于研究生水平。不同学历结核科医师对于本人学历层次的满意度差异有统计学意义(χ^2=29.21,P=0.001),本科学历人员的满意度为10.4%(14/134),研究生学历人员的满意度为22.0%(11/50),专科学历人员的满意度为20.0%(2/10)。90.2%(37/41)的医疗机构采取了一定的人才培养措施,75.6%(31/41)的单位可全额报销学历深造的学费,43.9%(18/41)的单位表示存在经费紧张的问题。对于脱产学习时长的倾向性单位与医师个人之间差异有统计学意义(χ^2=27.40,P<0.01):85.4%(35/41)的单位倾向于支持36个月的脱产学习,而46.4%(90/194)的医师更倾向于参加12年的脱产学习。78.0%(32/41)的单位和70.6%(137/194)的医师都认为“科室人员紧缺”是影响在职人员学习深造的主要因素,“个人学习意愿不强”[34.2%(14/41)]和“学习占用时间较长”[53.1%(103/194)]分别为两者选择的次要因素,另有34.2%(14/41)的单位和46.4%(90/194)的个人选择了“资金支持不足”。促进医师参加学习深造的措施,单位和个人对于“创造丰富多样的学习机会”的期望值均最高,分别占90.2%(37/41)和76.3%(148/194)。结论我国结核病相关医疗机构的医师受教育情况不理想,单位和医师之间对于在职学习的认知和期望存在差异。医疗机构需要贴合医师需求,支持医师学习深造,以创造更好的人才培养环境。

摘要：脲基衍生物是最新报道的一类具有抗结核活性的化合物,其主要作用机制是通过抑制质膜转运子MmpL3,从而抑制结核杆菌细胞壁的合成。AU1235作为此系列的代表化合物,存在药代性质较差的问题。本文以AU1235为先导化合物,通过骨架跃迁策略设计并合成了一系列新型苯并咪唑衍生物,并进行体外抗结核活性测试。结果表明,2-氨基苯并咪唑类化合物8b在保留良好抗结核活性(MIC 0.03μg·mL-1)的同时,其代谢稳定性得到了改善,为进一步的结构优化提供了重要参考。