摘要：目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMD^(TM)19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-lcrRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-lcrRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为10^(1)拷贝/μl的质粒和10^(0)拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于10^(6)拷贝/μl的MTE DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。

摘要：目的基于SYBR Green I荧光染料建立鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium ***)的荧光PCR熔解曲线法,为临床鉴定MA提供简单、准确性高的分子生物学检测方法。方法以MA的特异性插人序列ISI311为检测靶标设计引物,在60 C的退火温度下,建立鉴定MA的SYBRGreenI荧光PCR熔解曲线方法,并对MA等21种分枝杆菌标准株和金黄色葡萄球菌等5种常见致病菌进行检测,评价方法的特异性、检测限;以hsp65、16S rDNA普通PCR扩增产物测序分析为“金标准”,鉴定200株分枝杆菌临床分离株,评估建立方法鉴定MA的准确性。结果SYBRGreenI荧光PCR熔解曲线方法在30个循环内能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株和5种致病菌中的MA.检测限为5.6x 102 ng/μL。200株分枝杆菌临床分离株中,以PCR测序鉴定出16株MA和184株其他分枝杆菌,以SYBR Green I荧光PCR熔解曲线方法鉴定出15株MA和185株非MA;本研究建立的方法和测序方法对MA的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05);两法符合率为99.5%(199/200),一致性较高(Kappa值>0.75,P<0.01);建立方法的敏感性为93.8%(15/16),特异性为100.0%(184/184),阳性预测值为100.0%(15/15),阴性预测值为99.5%(184/185)。结论以MA特异性重复序列ISI311为基础建立的SYBR Green I荧光PCR熔解曲线方法,具有较高的灵敏度和特异性,为MA的临床检测提供新的途径。

摘要：目的建立结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）检测体系，并用于不同类型临床样本的检测。方法常规提取13株结核分枝杆菌和14株非结核分枝杆菌临床分离株DNA，9例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和4例其他肺部疾病患者痰DNA，12例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和7例健康者血浆DNA。设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针，建立ddPCR检测体系。应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数，进行统计学分析。结果建立了能同时检测IS6110和IS1081的ddPCR体系，该体系检测2个靶标的线性范围分别为0．5～8733和0．2～2893拷贝／μl反应体系。该体系具有较好的重复性（r〉0．95），以非结核分枝杆菌为对照检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100％。在痰和血浆DNA样本检测中，2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组。结论结核分枝杆菌特异性核酸的ddPCR体系，可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测，对提高结核病病原学诊断能力有重要意义。

摘要：目的研究原核类泛素（Pup）-蛋白酶体系统对分枝杆菌生长活力的影响。方法分别敲除耻垢分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统中pup和蛋白酶体β亚基基因（prcβ）。选取待敲除基因的上下游侧翼序列设计引物，构建自杀性载体，靶基因同源序列和菌株基因组发生同源重组后获得基因敲除的菌株。分别连续测定野生型和基因敲除株在正常及低氧和厌氧应激培养条件下的吸光度值，比较菌株生长活力的变化。结果正确构建敲除pup和prcB基因的突变株，分别命名为△SM-Pup和△SM—prcB。△SM-Pup菌株生长速度快于野生型菌株和△SM-prcB株。prcB基因的敲除对细菌的生长活力没有产生明显的影响。结论Pup-蛋白酶体系统对耻垢分枝杆菌的生长产生了一定作用，但具体机制仍需要进一步研究探讨。

摘要：目的结核分枝杆菌（***）潜伏感染状态是造成结核病诊断和研究的难点之一,目前的检测方法很难将潜伏感染结核病（LTBI）和活动性结核病（ATB）区分开.有文献报道分枝菌酸环丙烷合成酶（PcaA）和小分子热休克晶体蛋白（Acr）两个基因在***持留状态下高表达,因此可能和菌的潜伏感染相关,有作为新的诊断靶标的可能,因此我们对它们开展了有关的研究和应用,以期为LTBI的诊断提供新的研究方向和方法.方法首先针对目的基因设计引物,从基因组上扩增其全序列,构建克隆和表达载体,纯化分离蛋白.将蛋白作为抗原应用于免疫学的检测,用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中两种蛋白抗体的表达水平,最终经过统计学处理,分析LTBI和ATB患者之间的血清学的差异,寻找可应用于临床诊断分析的方法和策略.结果成功构建PcaA和Acr蛋白的克隆和表达载体,并获得表达和纯化的蛋白.血清的PcaA和Acr抗体水平检测结果显示健康对照（HC）与ATB之间差异有统计学意义,而ATB和LTBI之间差异并无统计学意义,即使将两个蛋白检测结果进行并联分析后也未显示差异有统计学意义.结论PcaA和Acr蛋白可以在大肠杆菌中成功表达并顺利纯化,PcaA蛋白有较高的抗原特异性和免疫反应性,可用于以后对结核病的检测分析中;虽然用血清学诊断时不能完整的区分LTBI和ATB,但可用于鉴别结核分枝杆菌感染与否.

摘要：目的结核分枝杆菌（***）潜伏感染状态是造成结核病诊断和研究的难点之一，目前的检测方法很难将潜伏感染结核病（LTBI）和活动性结核病（ATB）区分开。有文献报道分枝菌酸环丙烷合成酶（PcaA）和小分子热休克晶体蛋白（Acr）两个基因在***持留状态下高表达，因此可能和菌的潜伏感染相关，有作为新的诊断靶标的可能，因此我们对它们开展了有关的研究和应用，以期为LTBI的诊断提供新的研究方向和方法。方法首先针对目的基因设计引物，从基因组上扩增其全序列，构建克隆和表达载体，纯化分离蛋白。将蛋白作为抗原应用于免疫学的检测，用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中两种蛋白抗体的表达水平，最终经过统计学处理，分析LTBI和ATB患者之间的血清学的差异，寻找可应用于l晒床诊断分析的方法和策略。结果成功构建PcaA和Acr蛋白的克隆和表达载体，并获得表达和纯化的蛋白。血清的PcaA和Acr抗体水平检测结果显示健康对照（HC）与ATB之间差异有统计学意义，而ATB和LTBI之间差异并无统计学意义，即使将两个蛋白检测结果进行并联分析后也未显示差异有统计学意义。结论PcaA和Acr蛋白可以在大肠杆菌中成功表达并顺利纯化，PcaA蛋白有较高的抗原特异性和免疫反应性，可用于以后对结核病的检测分析中；虽然用血清学诊断时不能完整的区分LTBI和ATB，但可用于鉴别结核分枝杆菌感染与否。

摘要：目的体外构建表达原核类泛索蛋白（prokaryotic ubiquitin-like protein，Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础，为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸（his6）和链霉素（strep）标签的Pup蛋白表达载体，为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法设计合成his6-strep片段，扩增富集***片段，从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增Pup片段；应用Gibson Assembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和PUP片段依次连接到载体上，构建带双标签的原核表达载体pET28a—his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep—Pup表达载体，经酶切和聚合酶链反应验证，分别导人大肠杆菌（***）和耻垢分枝杆菌（***）中，鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株，超声破碎离心收集上清和沉淀，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）电泳，用免疫印迹法（Western blot）验证标签蛋白在***和***中的表达。结果经聚合酶链反应鉴定及测序，证实成功构建了双标签Pup表达载体并导人目的菌株，诱导后蛋白表达，Western blot结果表明标签蛋白在***和***中均可得到正确表达，在***中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论快速高效地构建了表达***蛋白的双标签重组载体，可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析，为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。

摘要：目的 体外构建表达原核类泛素蛋白 （prokaryoticubiquitin-likeprotein,Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础,为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸 （his6）和链霉素 （strep）标签的Pup蛋白表达载体,为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法 设计合成his6-strep片段,扩增富集his6-strep片段,从结核分枝杆菌 H37Rv基因组扩增Pup片段;应用GibsonAssembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和Pup片段依次连接到载体上,构建带双标签的原核表达载体 pET28a-his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep-Pup表达载体,经酶切和聚合酶链反应验证,分别导入大肠杆菌 （***）和耻垢分枝杆菌 （***）中,鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株,超声破碎离心收集上清和沉淀,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）电泳,用免疫印迹法 （Westernblot）验证标签蛋白在***和***中的表达。结果 经聚合酶链反应鉴定及测序,证实成功构建了双标签Pup表达载体并导入目的菌株,诱导后蛋白表达,Westernblot结果表明标签蛋白在***和***中均可得到正确表达,在***中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论 快速高效地构建了表达his6-strep-Pup蛋白的双标签重组载体,可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析,为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。

摘要：CRISPR-Cas免疫系统在天然状态下保护细菌和古生菌免受外来质粒或噬菌体的入侵.CRISPR-Cas9技术属于Ⅱ型CRISPR-Cas系统,它利用与靶序列互补的向导RNA引导Cas9酶定点切割DNA,该技术具有设计简单、操作方便、特异性强、效率高等优势,成为新一代基因组编辑技术.本文综述了CRISPR-Cas系统的最新分类和作用原理,重点介绍了近几年来CRISPR-Cas9系统应用于细菌学领域所取得的研究进展.

摘要：目的用基于多重PCR(mutiplex PCR,mPCR)扩增子的二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术(mPCR-NGS)检测MTB的耐药基因突变,并评估其检测石端包埋组织标本诊断耐药结核病的临床应用价值。方法选取北京市昌平区结核病防治所2013年4月至2015年10月常规进行了利福平、异烟阱、乙胺丁醇、链霉素、卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星和氧氟沙星比例法检测且具有药敏试验结果的50栋MTB临床分离株,包括42株耐药MTB和8株敏感MTB菌株。参考耐药基因数据库及相关文献,针对以上8种抗结核药物主要耐药基因及常见位点设计耐药基因组合,建立有效的检测方案。收集首都医科大学附属北京胸科医院病理科2017年11月至2018年9月耐药结核病患者55例的石蜡包埋组织标本,探针熔解曲线法检测结果为利福平、异烟腓、乙胺丁醇和氟喹诺酮类至少存在一种耐药相关基因突变。首先对已知表型药敏试验结果的MTB临床分离株进行mPCR-NGS检测,验证该方法检测纯菌样本的有效性,再进一步检测结核病患者石蜡包埋组织标本进行临床验证。主要评价指标为敏感度和特异度以及一致性。结果以比例法为金标准,mPCR-NGS检测利福平、异烟阱、链霉素和乙胺丁酶的敏感度分别为95%(3840)、93%(2729)、93%(217129)和72%(13/18),特异度分别为100%(10/10)、95%(20/21)、100%(21/21)和94%(30/32);二线注射类药物卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星敏感度均为100%(22,3/3,3/3),特异度分别为9%(47148)、100%(3/33)和100%(4747),氧氟沙星的敏感度为70%(710),特异度为100%(40/40)。总符合率为94%,一致性检验Kappa值为0.87。纳人的55例石蜡包埋组织标本经探针熔解曲线法检测,28例利福平耐药,37例异烟腆耐药,13例乙胺丁醇耐药,17例氟喹诺酮类耐药。mPCR-NGS与探针熔解曲线法比较,利福平、异烟阱、乙胺丁醇和氟喹诺郦类的敏感度分别为100%(28/28)95%(35/37)、:100%(13/13)和100%(17/17);特异度均为100%(27/27,18/18,42/42,38/8)。两种方法总符合率为99%,一致性检验Kappa值为0.98。结论mPCR-NGS检测MTB临床分离株及结核病患者石蜡包埋组织标本耐药基因突变的敏感度、特异度和符合率较高,有望成为耐药结核病准确、快速的分子病理诊断新技术。