摘要：建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。

摘要：苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea malicorticis、***、***和***)是我国检疫性植物病原真菌,为建立该病菌的实时荧光PCR检测法,根据病菌及其近缘种的翻译延伸因子(EF-1α)的保守序列设计了特异性探针,分别以苹果牛眼果腐病菌菌株和本研究构建的EF-1α重组质粒DNA为阳性标准品检验探针的特异性和灵敏度。结果显示探针MAL-P、PER-P、ALB-P和KIE-P分别对***、***、***和***表现特异性阳性扩增,而与近缘种及其他常见的果腐病菌无交叉反应,单重探针和4种探针混合液的灵敏度分别达1 fg/μL和10 fg/μL DNA。总计从美国、智利、新西兰、法国进境截获的29批可疑病果的分离物中检测到PCR阳性荧光信号,包括20批***、8批***和1批***。该方法在6 h内即可完成整个检测流程,其特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中苹果牛眼果腐病菌的快速检测。

摘要：为实现转基因甜菜品系H7-1的标识管理和精准定量,根据H7-1的5’边界序列和甜菜谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase,GS)设计引物和探针建立双重数字PCR检测体系。该方法的特异性、灵敏度、精密度和准确度均进行了测试。结果显示:建立的转基因甜菜H7-1数字PCR检测方法特异于H7-1品系检测,在20μL反应体中H7-1品系特异性序列和内源基因GS的定量下限(limit of quantitation,LOQ)分别为3.1拷贝/μL和6.3拷贝/μL,检测下限(limit of detection,LOD)检出限分别为0.6拷贝/μL和1.3拷贝/μL,精密度和准确度在可接受范围内,该定量方法不依赖于标准曲线建立,可便捷的应用于转基因甜菜H7-1成分的精确定量检测。

摘要：目的实现转基因鲑鱼AquAdvantage的标识管理,建立其品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。方法针对转基因鲑鱼的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因鲑鱼实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因鲑鱼实时荧光PCR方法特异性强,在600 000~60拷贝范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为y=-3.2194x+40.805,R^2=0.997,检测限为60拷贝,检测重复性良好。结论建立的品系特异性实时荧光PCR方法可应用于转基因鲑鱼AquAdvantage的鉴定。

摘要：目的建立基于TaqMan探针三重荧光PCR检测沙门菌(salmonella,Sa)、肠炎沙门菌(salmonella enteritidis,SE)和鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium,ST)的方法。方法根据沙门菌aceA基因、肠炎沙门菌特异序列(GenBank:AF370707.1)、鼠伤寒沙门菌的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1),分别设计引物和TaqMan探针,在探针的5′端分别标记FAM、VIC、cy5,建立基于TaqMan探针三重实时荧光PCR检测沙门菌的方法。结果 29种不同血清型沙门菌均扩增出aceA基因,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的引物和探针分别特异性地扩增出15株肠炎沙门菌和11株鼠伤寒沙门菌,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性。aceA、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的三重荧光PCR扩增效率分别为89%、87%、90%,最低检测浓度分别达到280cfu/ml、260cfu/ml、300cfu/ml。结论本研究建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的特异性检测。

摘要：目的探讨用实时荧光PCR对沙门菌进行种间鉴别。方法根据猪霍乱沙门菌(Salmonella Choleraesuis,SC)和丙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi C,SP)的共有序列(Gen Bank:AE017220.1),伤寒沙门菌(Salmonella Typhi,ST;Gen Bank:NC_016832.1)和鸡伤寒沙门菌(Salmonella Gallinarum,SG;Gen Bank:HQ703462)的特异序列分别设计SCP、STP、SGP引物和Taq Man探针,在探针的5'端分别标记FAM、HEX、TET,建立基于Taq Man探针多重荧光PCR检测方法。同时,根据SC和SP差异序列(Gen Bank:CP000857)设计SPP引物和探针,在探针的5'端标记ROX,区分SC和SP。结果 SCP特异性扩增出25株SC和22株SP,STP和SGP分别扩增出31株ST和34株SG,而其他不同血清型沙门菌和非沙门菌扩增结果阴性。SPP扩增出22株SP,25株SC扩增结果阴性。扩增体系评价结果,SCP、STP、SGP和SPP扩增效率均在80%~100%,线性相关系数r2≥0.994。结论建立的方法特异性强、敏感性高,可用于SC、SP、ST、SG的种间鉴别。

摘要：为快速准确检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌,分别根据化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌ICEMh1基因和肺炎链球菌pspC基因的特异性序列设计引物和探针,以重组质粒a.p-m.h1-s.p为标准品,通过优化反应条件,建立一种检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏度和可重复性进行测试。结果表明,建立的方法对标准品阳性质粒的最低检测量为20拷贝,标准曲线在1.25×10^6 copies/μL^1.0×101 copies/μL范围内具有良好的线性关系。对2016年-2018年在陕西省收集的病料中化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌检出率分别为66.67%、5.5%和44.44%。建立的三重实时荧光定量PCR方法能快速、准确和稳定地检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌。