摘要：旨在建立犬瘟热病毒(CDV)和犬腺病毒2型(CAdV-2)双重TaqMan荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。本试验针对CDV的N基因和CAdV-2的E3基因设计两对特异性引物与两条标记不同荧光基团的TaqMan-MGB探针,对引物、探针的浓度、反应体系和反应条件进行优化后检测该方法的灵敏度,特异性及重复性。结果:该方法在CDV和CAdV-2阳性参考质粒浓度1×10^(1)~1×10^(7) copies/μL的范围中,R2值为0.997和0.993,表明所建的标准曲线具有良好线性关系,能检测到最低浓度为5 copies/μL,并对其他病原无扩增现象,特异性良好;重复性试验中组内和组间变异系数小于1.54%。综上,建立的双重TaqMan RT-qPCR检测方法具有灵敏度高且特异性好等优点,可用于CDV和CAdV-2临床快速检测和鉴别诊断及流行病学调查等领域。

摘要：【目的】设计针对猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)S、M及E蛋白的多表位疫苗。【方法】本研究选用IEDB预测SADS-CoV S、M及E蛋白T淋巴细胞主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)类分子结合表位;用NetMHCIIpan 4.0 Serve预测T淋巴细胞MHCⅡ类分子结合表位;用Immunomedicine Group、IEDB预测B淋巴细胞表位。将各个服务器预测结果筛选出重叠表位区域作为优势表位,运用IEDB、AllerTOP v 2.0 Servers筛选出高保守性、非致敏性的优势表位区域,通过柔性linker串联成多表位疫苗。对构建的多表位疫苗进行抗原性、理化性质、N-糖基化位点、二级结构和三级结构预测。使用分子对接评估多表位疫苗与免疫受体的结合能力,最后进行基因克隆。【结果】经筛选后的高保守性、非致敏性优势表位构建的多表位疫苗相对分子质量为35.30 ku,为稳定亲水蛋白,具有良好的抗原性,存在1个N-糖基化位点,在二级结构中α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和β-转角分别占22.11%、20.35%、50.88%和6.67%。三级结构Ramachandran作图显示优势区域中含有残基数占到90.00%,进行细化后优势区域的残基数增加到91.92%,三级结构突出表位作图也证明多表位疫苗具有良好的免疫原性,分子对接表明多表位疫苗与TLR3具有高亲和力。经密码子优化、反向翻译和基因克隆确保设计的多表位疫苗在大肠杆菌K12表达系统中高效、稳定的表达。【结论】构建的多表位疫苗抗原可有效表达并可能诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为SADS-CoV多表位疫苗的设计提供了一种新的方法,为SADS-CoV多表位疫苗的研发提供了理论依据及数据支持。

摘要：γ-谷氨酰转移酶7(GGT7)是华支睾吸虫生长发育的各个时期都存在且高表达的蛋白,为探索其作为诊断抗原的潜能,依据GenBank中华支睾吸虫GGT7基因序列,设计了特异性引物,并构建了pET-32a-GGT7重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,进行蛋白表达和反应原性分析。生物分子信息学分析显示,GGT7具有7个α-螺旋和6个β-折叠,B细胞抗原基因表位较多。扩增得到的华支睾吸虫GGT7基因大小为1773 bp,编码591个氨基酸,SDS-PAGE分析在65 ku分子处有明显的目的蛋白条带,Western blot检测表明该蛋白具有较好的反应原性。首次对华支睾吸虫GGT7基因进行了克隆表达,并证明目的蛋白具有良好的反应原性,为华支睾吸虫病诊断试剂的研发奠定了基础。

摘要：为了建立犬冠状病毒(CCoV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法,试验通过分析比对NCBI下载的犬冠状病毒(CCoV)全基因组序列,在其3′UTR保守区设计一对特异性引物及TaqMan探针,经反应条件优化,建立CCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。利用建立的检测方法检测CCoV标准品,绘制标准曲线,检测建立方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测,且与普通RT-PCR检测结果进行比较,计算符合率。结果表明:标准曲线方程为y=3.25x+10.84,相关系数为0.996 4,在2.61×10^(1)~2.61×10^(8)拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。除CCoV检测结果为阳性外,犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬副流感病毒检测结果均为阴性;检测下限为2.61×10^(1)拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%。建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检出阳性临床样品9份,而普通RT-PCR检出阳性临床样品5份,两种检测方法的符合率为91.66%。说明建立的CCoV TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于犬冠状病毒病的临床检测。

摘要：为了制备产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P和K88的二价重组乳杆菌,并检测其免疫效果,试验根据ETEC C83916株(GenBank登录号M35257.1)987P基因序列和ETEC C83902株(GenBank登录号M29375.1)K88基因序列设计合成特异性引物,将PCR扩增的987P、K88基因连接至穿梭载体pHCE1LB-pgsA(简称pLA),热激法转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经PCR、双酶切鉴定为阳性的重组质粒电转化入干酪乳杆菌中,通过Western-blot、间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。将50头健康的初生仔猪分为试验组和对照组,试验组初生仔猪通过口服免疫重组干酪乳杆菌菌液(浓度为1×10^(9) cfu/mL),对照组口服等体积生理盐水,连用5 d,在免疫前称量体重,并于免疫前(第0天)及免疫后第5,10,15,20,25天采集血液和粪便,采用ELISA检测血清IgG抗体和粪便中sIgA抗体水平;免疫后10天试验组和对照组分别随机选取20头仔猪用ETEC C83916株和C83902株进行攻毒,计算攻毒保护率,试验结束后称量仔猪体重。结果表明:成功构建了重组菌pLA-987P-K88/***,Western-blot检测显示pLA-987P-K88/***在85 ku处出现明显条带,在荧光显微镜下pLA-987P-K88/***可观察到明显的绿色荧光。初生仔猪免疫重组菌pLA-987P-K88/***后5~25 d,IgG抗体和sIgA抗体水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。重组菌对ETEC C83916的攻毒保护率为90%,对ETEC C83902的攻毒保护率为80%。说明ETEC 987P、K88二价重组干酪乳酸菌可以有效抑制仔猪感染ETEC,大大降低新生仔猪腹泻率。

摘要：为了建立能够猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和非洲猪瘟病毒(African swine fe⁃ver virus,ASFV)双重荧光定量PCR方法,试验比对了CSFV与ASFV的基因组序列,针对CSFV 5′-UTR和ASFV B646L保守靶序列,分别设计2条特异性引物及1条TaqMan探针,通过优化扩增体系和程序,建立可同时检测CSFV和ASFV的双重荧光定量PCR方法,并建立该方法的标准曲线,同时用敏感性试验、特异性试验和重复性试验对该方法进行评价,最后检验该方法的应用效果。结果表明:CSFV和ASFV标准曲线的相关系数(R2)分别为0.999和1,线性关系良好;CSFV与ASFV的最低检测浓度分别为1.3×100 copies/μL和2.4×100 copies/μL;与其他常见猪只病原检测无交叉反应;批间与批内变异系数均小于2%,稳定性良好。试验建立的方法对44份临床样本的检测结果与《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)和《非洲猪瘟诊断技术》(GB/T 18648—2020)检测结果一致。说明试验建立的双重荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定,可用于CSFV和ASFV的快速检测和鉴别诊断。

摘要：为了将玉米秸秆作为日粮用于东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)的养殖中,实现“以害治废,害废变宝”,试验首先采用正交试验设计探究不同温度水平(23℃、28℃、33℃)和相对湿度水平[低湿度(相对湿度20%~30%)、中湿度(相对湿度50%~60%)、高湿度(相对湿度80%~90%)]下东亚飞蝗29 d的增重情况(体重增长指数)和成活率,然后基于蝗虫嗜食禾本科青绿幼嫩牧草茎叶的习性和营养需求,以及尽可能消纳更多玉米秸秆的原则设计日粮配方,采用随机区组设计将450只3龄东亚飞蝗蝗蝻随机分为5组(A、B、C、D、E组),30只/网箱,1个网箱为1个重复,每组3个重复,A组饲喂100%苜蓿草粉,B组饲喂100%玉米秸秆粉,C组饲喂83%玉米秸秆粉+12%苜蓿草粉+5%蔗糖,D组饲喂95%玉米秸秆粉+5%蔗糖,E组饲喂100%青绿黑麦草,试验期为29 d,试验结束后测定在适宜的养殖温度和湿度下各组日粮总消耗量、成活率、总增重、料重比和增重成本,研究玉米秸秆日粮对东亚飞蝗生长状况和养殖效益的影响。结果表明:东亚飞蝗在28℃、低湿度(相对湿度20%~30%)条件下体重增长指数和成活率最高;5组日粮总消耗量表现为E组>C组>B组>D组>A组,成活率表现为E组>C组>D组>B组>A组,总增重表现为E组>C组>D组>B组>A组,料重比表现为A组>B组>D组>C组>E组,增重成本表现为A组>D组>E组>C组>B组,C组和E组的日粮总消耗量、成活率、总增重均显著高于其他3组(P<0.05),料重比显著低于其他3组(P<0.05),增重成本较为接近;其中C组在具有较高养殖效益的同时,可有效消纳玉米秸秆。说明东亚飞蝗的适宜生长条件为温度28℃、相对湿度20%~30%;在此条件下,用83%玉米秸秆粉+12%苜蓿草粉+5%蔗糖饲喂东亚飞蝗,可充分利用蝗虫消纳玉米秸秆,并为东亚飞蝗养殖带来较高的效益。

摘要：为了探究添加鲜羊粪对盐碱退化羊草草地的影响,以黑龙江省西部中度盐碱退化羊草草地为试验对象,分析不同鲜羊粪添加量对草地植物群落特征、土壤盐碱特性及土壤团聚体稳定性的影响。试验采用单因素随机区组设计,设置对照,羊粪添加量1.25 kg/m^(2)、2.50 kg/m^(2)、3.75 kg/m^(2)、5.00 kg/m^(2)共5个处理,羊粪添加处理持续60 d。结果表明:随着羊粪添加量的增加,植物群落高度和群落盖度呈显著上升趋势(P<0.05);施用羊粪2.50 kg/m^(2)时,植被地上生物量显著高于其他处理(P<0.05),单位面积鲜重增长了92.64%,干重增长了62.11%;添加羊粪能够提高土壤含水量,显著降低土壤电导率,羊粪添加量为2.50 kg/m^(2)和5.00 kg/m^(2)时,0~10 cm土层土壤电导率显著低于其他处理(P<0.05);羊粪添加能够显著改善盐碱退化羊草草地的土壤团聚体组成(P<0.05),增加5~10 mm粒径土壤团聚体所占比重,极显著提高土壤平均质量直径和平均几何直径(P<0.01),羊粪添加量为2.50 kg/m^(2)时,0~10 cm土壤团聚体稳定性最高。因此,本研究得出添加鲜羊粪最适用量为2.50 kg/m^(2),能够对退化羊草草地生态恢复起到良好的正向促进作用。

摘要：以抗菌肽CC34的氨基酸序列为模板,采用氨基酸从头替换的方式对序列进行设计,借助生物信息学方法对预测不同序列的抗菌肽生物学参数,选取优化肽CC34PA、CC34PL、CC34K11、CC34P11进行化学合成,鉴定抗菌肽的抑菌活性、检测最小抑菌浓度、杀菌浓度和溶血率。结果表明,四种肽均属于α螺旋型抗菌肽,具有比CC34更好的非完美两亲性,对革兰氏阳性菌和阴性菌有抑制作用,除对产气肠杆菌的作用效果不及CC34之外,优化肽对不同的试验菌种的抑菌作用均有有不同程度的提高。优化肽相比于原肽对绵羊红细胞的溶血率降低,溶血率最低的是CC34K11;对鸡红细胞溶血率降低,溶血率最低的是CC34PA;对人红细胞溶血率没有降低作用。

摘要：研究旨在探讨北方寒区温度对紫花苜蓿青贮发酵品质及营养成分的影响,采用小规模双因素设计(温度×贮藏时间),设置常温组[(25±2)℃,RT组]与低温组[(4±2)℃,LT组],分别在青贮1、3、5、7、15、30 d与60 d开封取样,分析感官品质以及青贮过程中营养成分、发酵品质和微生物变化。结果表明:随着青贮时间的延长,LT组青贮颜色、质地、气味等感官变化与常温青贮相比均较为缓慢,蛋白质(CP)和干物质(DM)损失量在30 d后趋于稳定,中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量随贮藏时间的延长呈下降趋势,但青贮30 d和60 d无显著差异;两组pH均呈现下降趋势,与青贮1 d相比,RT组在青贮7~30 d时pH显著下降(P0.05),说明30 d青贮发酵基本趋于稳定;两组的乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和氨态氮/总氮(NH3-N/TN)值均呈上升趋势,RT组LA含量从7 d开始显著高于LT组(P<0.05);两组乳酸菌数量均呈现明显的上升趋势(P<0.05),在30 d到达顶点;15 d后,LT组乳酸菌数量显著低于RT组(P<0.05),RT组好氧性细菌数量在1~3 d内呈上升趋势,3 d后开始下降(P<0.05)。由此说明,低温季节或地区不利于紫花苜蓿常规青贮,需要在青贮中添加耐低温乳酸菌以改善发酵品质。