摘要：背景：对于CD40通路的研究以往多集中在器官移植，涉及异体肢体方面的报道较少。目的：探讨靶向CD40的小分子RNA干扰对大鼠异体肢体移植急性排斥反应、细胞凋亡的影响，检测CD40通路阻滞后相关基因的表达变化。设计、时间及地点：细胞基因工程体内实验，于2007—09／2008—02在哈尔滨医科大学附属第一医院中心实验室完成。材料：清洁级10～12周龄雄性Wistar受鼠、SD供鼠各27只，行同种异体右后肢移植。真核表达质粒pSilencer4．1-CMV neo为Ambion公司产品。pSilencer4．1-CD40shRNA重组质粒由哈尔滨医科大学附属第一医院中心实验室保存。梭华-Sofastr^TM in vivo体内转染试剂为厦门太阳马生物工程有限公司产品。方法：27只Wistar受鼠异体肢体移植完成后随机分为3组，9只／组。干扰组经阴茎背静脉注入梭华-Sofast（15 μL）-siCD40—2／pSilencer（100μg）载体复合物600μL，空载体组等量注入梭华-Sofast（15μL）-pSilencer4．1-CMV neo（100μg）空载体复合物，对照组等量注入生理盐水，连续注射6d，1次／d。主要观察指标：观察移植物排斥反应征象及移植肢体存活时间，检测细胞凋亡情况，免疫组织化学染色检测p53，p21，Bcl-2，Bax的表达。结果：干扰组未见排斥反应征象，且移植物发牛排斥反应的时间及存活时间均显著长于空载体组、对照组（t=3．137～3．519，P〈0．01）；空载体组、对照组于移植后近期发生排斥反应。干扰组移植后第1，3，5，7天细胞凋亡指数均明显低于空载体组、对照组（t=3．636-4．786，P〈0．01）。干扰组移植后各时间点P53，P21，Bax的表达均明显低于空载体组、对照组（t=3．586-4．531，P〈0．01）；Bcl-2的表达均明显高于空载体组、对照组（t=3．664—4．644，P〈0．01）。结论：在不应用免疫抑制剂的情况下，靶向CD40的小分子RNA干扰可以减轻大鼠异体肢体移植后的急性排斥损伤，抑制细胞凋亡，可能与其对p53，p21，bcl-2，bax基因的调节密切相关。

摘要：有关皮瓣移植的讨论意见范遗恩一、有关皮瓣名词概念皮瓣是带蒂移植的皮肤及其附着的皮下脂肪层所构成的组织块，它包括皮肤、皮下组织及皮肤附属器官或深筋膜。皮瓣设计和切取的基础是移植皮肤之血管分布和血液供应。因而皮瓣应有一个与供区相连内含供应血管的蒂或有与受...

摘要：目的探讨体内转录法合成的小干扰RNA（siRNA）对淋巴细胞共刺激分子CD40基因表达的影响。方法设计并合成4条siRNA（si40-1、si40-2、si40-3、si40-4），在阳离子脂质体的介导下转染SD大鼠淋巴细胞。于转染48h收集细胞，半定量RT-PCR方法检测CD40mRNA，流式细胞仪检测CD40表达。结果流式细胞仪检测显示，si40-1、si40-2、si40-3、si40-4组的CD40表达抑制率分别为（21．10±1．54）％、（74．40±1．03）％、（41．80±0．86）％、（36．02±0．76）％，均明显高于空白对照组[（3．01±0．82）%]（P〈0．01），其中以si40-2的CD40抑制作用最强。半定量RT-PCR检测显示，与空白对照组比较．4组siRNA转染后淋巴细胞CD40mRNA均受到明显抑制伊〈0．01）．其中si40-2组的抑制作用最明显。结论sIRNA可特异性抑制淋巴细胞共刺激分子CD40基因的转录和表达，从而为进一步研究siRNA在移植免疫耐受及防治移植物抗宿主疾病（GVHD）方面的应用提供了理论和实验基础。

摘要：背景:站立侧屈、仰卧侧屈、侧方按压、俯卧推压和牵引下摄X射线片对预测哈氏法和卢氏法手术的矫正效果确实有效,但均不能更好地预测目前应用的三维椎弓根钉棒矫形系统的矫正效果。目的:评估术前支点弯曲位、重力悬吊牵引位和仰卧侧屈位X射线平片在预测青少年特发性脊柱侧凸三维矫形融合术效果的价值。设计:对比观察。单位:解放军第二一一医院骨科(全军骨科中心)。对象:选择2003-01/2005-12解放军第二一一医院骨科就诊的63例青少年特发性脊柱侧凸患者,男18例,女45例,年龄10￣21岁。均经临床检查及X射线平片诊断为青少年特发性脊柱侧凸;Cobb角≥40°;患者均对检测项目知情同意。方法:术前对63例青少年特发性脊柱侧凸患者的79个结构性侧凸摄站立位全脊柱正侧位片、支点弯曲位片、重力悬吊牵引位片和仰卧侧屈位片,术后1周时摄站立位全脊柱正侧位片。主要观察指标:青少年特发性脊柱侧凸术前支点弯曲位Cobb角与术后实际Cobb角。结果:患者63例均进入结果分析。术前支点弯曲位Cobb角与术后站立位比较,差异无显著性意义(P>0.05);而术前重力悬吊牵引位和仰卧侧屈位Cobb角与术后站立位比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:支点弯曲位X射线平片比重力悬吊牵引位和仰卧侧屈位X射线平片能更准确地预测术后矫正效果,而重力悬吊牵引位与仰卧侧屈位摄片的预测结果相似。

摘要：背景:大量实验证明,Bungner带-许旺细胞-基底膜结构是神经再生理想的微环境。这一结构在神经损伤两三周后形成。而在神经损伤数小时后,近断端的神经纤维就开始发芽再生神经纤维开始再生与所需微环境的形成并不同步。目的:观察周围神经损伤后不同时间进行修复的最佳效果。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-06在哈尔滨医科大学动物实验中心完成。材料:新西兰大白兔20只,随机数字表法分为4组:2周后神经修复组、4周后神经修复组、3个月后神经修复组、即时神经修复组。方法:建立成年新西兰大白兔周围神经损伤模型,即时修复组立即缝合伤口,2周后神经修复组、4周后神经修复组、3个月后神经修复组采用神经两断端分别固定于肌膜上,逐层缝合伤口,2周,4周,3个月后重新打开伤口,在手术显微镜下用10-0无损伤尼龙针线进行外膜缝合修复坐骨神经,缝合伤口。主要观察指标:各组缝合神经段的神经电生理、轴突数、光镜及电镜观察结果。结果:2周后神经修复组神经传导速度慢于4周后神经修复组、3个月后神经修复组(P0.05)。2周后神经修复组效果最好,神经纤维走行正常、排列完好,神经纤维可见血管增生,髓鞘结构较好,许旺细胞功能活跃,新生轴突内微丝密集排列。4周后神经修复组最差,神经纤维数量少、排列紊乱,髓鞘轴突变性明显,大部分神经纤维脱髓鞘崩解,轴突消失,未见再生神经纤维。3个月后神经修复组效果较差,可见较多神经纤维结构破坏,排列略紊乱,髓鞘和轴突变性较明显,仅见少量再生神经纤维,许旺细胞略少,胞质不发达。即时进行神经修复组效果较好,神经纤维结构破坏不明显,排列整齐,髓鞘和轴突变性轻,神经纤维内见有大量再生髓鞘,许旺细胞明显增多,胞质较发达。2周后神经修复组轴突计数优于其他3组(P<0.05),4周后神经修复组最少。结论:神经损伤2周后进行神经修复效果优于其他时间点,是周围神经损伤后修复的最佳时机。

摘要：背景:生长分化因子5是一种刺激肌腱、韧带塑型,增强愈合反应有效的生长因子,在活性组织工程肌腱构建中有重要作用。目的:构建人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒,为转染基质干细胞向肌腱诱导分化实验奠定基础。设计、时间及地点:细胞基因工程体外实验,于2007-08/12在哈尔滨医科大学遗传学教研室和分子生物学教研室完成。材料:根据Genbank(NM000557)中人生长分化因子5的序列化学合成一对引物,从人胎儿软骨组织提取总RNA。方法:通过反转录-聚合酶链反应得到人生长分化因子5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体pcDNA6.2并转化入JM109菌株,提取重组质粒,PCR鉴定、酶切鉴定并测序。主要观察指标:反转录-聚合酶链反应检测结果,PCR及SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定结果,重组质粒测序与Genbank中序列比较结果。结果:电泳显示,反转录-聚合酶链反应产物为一长约380bp的带,阳性克隆质粒经PCR电泳及双酶切均出现约380bp的片段。测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论:成功构建出人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒,为组织工程化肌腱过程中种子细胞的制备提供转染质粒。

摘要：背景:肢体移植是一种复合组织移植,有研究提出靶细胞的凋亡是移植物丧失功能的主要机制之一。目的:采用大鼠异体肢体移植模型观察同种异体肢体移植急性排斥反应中的细胞凋亡特征。设计:以实验动物为研究对象,随机对照研究。单位:一所医科大学医院实验动物中心实验室。材料:实验于2003-11/2004-05在哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心实验室完成。健康雄性SD大鼠56只、Wistar大鼠28只,体质量200～250g,由哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心提供。移植组供、受体分别为Wistar及SD大鼠(各28只),对照组为SD大鼠(各28只)。干预:建立大鼠异体肢体移植模型(移植组)及自体肢体再植模型(对照组),观察急性排斥反应出现时间及表现,术后1,3,5,7d切取移(再)植体组织标本,苏木精-伊红(HE)染色进行各组织排斥反应的病理分级,原位末端标记(TUNEL)法检测各组织细胞凋亡情况,计算凋亡指数。主要观察指标:主要结局:①移植肢体急性排斥反应的病理分级。②移植肢体细胞凋亡指数与急性排斥反应的关系。次要结局:各组大鼠术后一般情况。结果:移植肢体术后(3.43±0.79)d开始出现皮下水肿、皮色变红,平均存活时间为(7.42±1.72)d,移植组织中皮肤排斥反应程度最强,病理分级术后3,5,7d分别为(1.14±0.38),(2.28±0.48)。

摘要：背景:许旺细胞是周围神经系统中惟一的神经胶质细胞,在周围神经再生中有重要的作用,但其存在增殖能力差,需要异体取材,体外培养困难和活性下降等缺点。目的:分析利用人骨髓基质干细胞经诱导分化为许旺细胞构建组织工程化神经修复神经缺损的可能性。设计、时间及地点:随机分组设计、动物对照观察,2004-03/2005-04在黑龙江省兽医药研究所完成。材料:8周龄雌性Wistar大鼠24只。建立10mm坐骨神经缺损的动物模型。方法:24只大鼠按随机数字表法分为3组,组织工程化神经移植组、单纯聚乳酸导管移植组、自体神经移植组,每组8只。组织工程化神经移植组:经诱导骨髓基质干细胞分化许旺细胞与天然细胞外基质凝胶及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经桥接神经缺损;单纯聚乳酸导管移植组:单纯将细胞外基质凝胶注入可降解聚乳酸导管桥接神经缺损;自体神经移植组:将截取的10mm神经旋转180°后,行断端吻合。主要观察指标:移植后12周进行神经电生理、新生神经组织学观察和轴突计数等检测坐骨神经功能恢复情况。结果:诱导后成人骨髓基质干细胞具有许旺细胞形态及特性。移植后12周,再生神经已通过缺损区长至远端。组织工程化神经移植组、自体神经移植组各项检测指标均优于单纯聚乳酸导管移植组(P0.05);组织工程化神经移植组、自体神经移植组聚乳酸导管降解吸收明显。结论:人骨髓基质干细胞在体外可诱导分化为许旺细胞,利用其与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经可修复周围神经缺损。

摘要：背景:异种脱蛋白松质骨因其来源广泛和独特的生物学特性有望成为较好的骨组织工程支架,其关键点为免疫原问题,如能解决免疫原问题,则有望开发出一种新型植骨材料。目的:通过理化方法制备脱蛋白松质骨,对其结构、组成及生物安全性能进行分析,探讨异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体可行性。设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-02/2009-01在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成。材料:取成年猪和山羊股骨远端松质部分,1∶1氯仿甲醇液脱脂、体积分数30%H2O2脱蛋白,制得脱蛋白松质骨。方法:①通过红外光谱仪、X射线衍射分析仪、氨基酸分析仪、力学测试仪进行载体性能测试。②取第3代人髂骨骨髓间充质干细胞调整浓度为2×108L-1细胞悬液,接种到载体至饱和,倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞黏附及生长增殖情况。③40只BALB/C小鼠随机分为实验组和对照组,每组20只。分离小鼠股后肌肉制成肌袋,实验组植入猪脱蛋白松质骨,对照组直接缝合。术后1,2,4,8周检测分析血清肌苷、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平。④采用免疫酶组织染色方法分析猪脱蛋白松质骨和植入小鼠体内4周脱蛋白松质骨标本的免疫原性。主要观察指标:体外实验分析脱蛋白松质骨理化性能、免疫原性。动物实验分析生物安全性能。结果:脱蛋白松质骨载体无机成分主要是与人骨天然成分相同的羟基磷灰石,经过一系列处理后,胶原蛋白并没有被脱除,这种结构保持了较好的力学性能。脱蛋白松质骨由于脱除了主要的免疫原性物质,其免疫原性较弱,毒性低。人骨髓间充质干细胞接种于载体后生长分化良好。结论:异种脱蛋白松质骨是一种良好骨组织工程载体。

摘要：背景：转基因细胞移植可以提高成骨细胞数量及成骨活性，有可能成为骨缺损的重要修复方法。目的：构建人骨形态发生蛋白2真核表达载体，鉴定并转染兔骨髓基质细胞，应用基因治疗的方法修复兔桡骨缺损，观察其成骨效果。设计、时间及地点：单一样本观察及同体对照动物实验，于2004-06/2006-02在哈尔滨医科大学附属第一医院中心实验室完成。材料：克隆质粒psp-65BMP2为解放军第四军医大学171腔医院惠赠；pcDNA3．1表达载体购自Invitrogen公司；清洁级新西兰白兔32只，雌雄不限，体质量为2～2．5kg。方法：双酶切克隆载体将骨形态发生蛋白2目的基因与真核表达载体pcDNA3．1连接。将自体骨髓基质细胞修复兔桡骨缺损。分别于16只新西兰白兔缺损处植入载有转基因细胞的胶原，对侧植入单纯胶原对照。16只新西兰白兔缺损处植入载有自体细胞的胶原，对侧植入单纯胶原对照。主要观察指标：①免疫组织化学及Western blotting检测转染骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞的表达效果。②术后12周麻醉后处死动物，行缺损处大体观察、X射线观察及组织学和电镜观察。结果：①成功构建骨形态发生蛋白2真核表达载体，转染骨髓基质细胞后，免疫组织化学染色，可在骨髓基质细胞胞浆显示棕色阳性染色：Western blotting检测有针对骨形态发生蛋白2抗体的蛋白条带，证实骨形态发生蛋白2表达。②组织学和电镜观察实验侧骨缺损处可见大量成骨细胞及新生基质。对照侧仅在断端间见少量骨细胞，断端处为纤维组织充填：转基因骨髓基质细胞修复骨缺损完全愈合：大体及X射线观察转染实验侧有连续骨痂通过骨缺损处，对照侧无连续骨痂通过断端。结论：骨髓基质细胞经基因转染后可以表达骨形态发生蛋白2，并可以修复骨缺损。