摘要：为了能快速鉴别猪伪狂犬病病毒流行株,根据猪伪狂犬病病毒gE基因前半段95 bp~210 bp区域处设计一对特异性引物及探针,优化反应条件后,建立一种可鉴别猪伪狂犬病病毒gE缺失疫苗株与流行株的Taqman荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法对pMD-PRV gE阳性标准质粒的最低检出下限为4.4×10^(1)拷贝/μL;该方法特异性强,对猪常见病毒性疾病(猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等)均无交叉反应,将PRV流行株和疫苗株(Bartha-K61株、HB2000株、C株、Ea株)同时与某商品化试剂盒对比检测,特异性优于某商品化荧光定量PCR检测试剂盒;组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.6%,重复性好。应用本研究建立的荧光定量PCR检测方法对165份临床样品进行检测,阳性率为2.42%(4/165),选取已知3份阳性的30份临床样品,与商品化检测试剂盒比对,符合率100%。因此,本研究建立的PRV gE基因荧光定量PCR检测方法可用于猪伪狂犬病病毒流行株的快速诊断和流行病学调查,为PR的控制与净化提供技术支持。

摘要：以红腰豆总黄酮粗提液为原料,研究大孔树脂对红腰豆黄酮的纯化工艺和效果,比较了8种树脂对红腰豆总黄酮的静态吸附和解吸性能,对AB-8型大孔树脂分离纯化红腰豆总黄酮进行了单因素、BoxBenhnken中心组合设计和响应面法优化试验,并考察了红腰豆总黄酮纯化前后体外抗氧效果。结果表明:AB-8树脂为纯化红腰豆总黄酮的最佳树脂,其最佳的吸附工艺条件为:上样质量浓度4.0 mg/m L,上样液pH 6.3,上样流速2.0 m L/min,上样体积5.0 BV,在此条件下吸附率可达(98.03±0.30)%;最佳的解吸工艺条件为乙醇体积分数75%,洗脱流速3.0 m L/min,洗脱体积2.0 BV,在此条件下解吸率可达(94.52±0.24)%。纯化后红腰豆总黄酮纯度提高了约2.85倍,纯化前DPPH·、·OH和O-2·的清除率IC50值分别为1.18、1.40、6.51 mg/m L,纯化后分别为0.37、0.82、1.77 mg/m L,纯化后红腰豆总黄酮提取物的体外抗氧化活性明显增强。

摘要：为了建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的快速鉴别诊断方法,试验根据GenBank中已发表的PEDV和TGEV的相关基因序列,设计合成特异性引物,分别进行单项PCR最佳反应条件的摸索;确定最佳反应条件后建立PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法,并进行特异性分析;同时采用单项RT-PCR和二重RT-PCR法检测临床样本,比较两种方法的检出率。结果表明：试验成功建立了PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法,经最佳退火温度摸索,二重RT-PCR法的最佳退火温度为58.1℃;经特异性分析,二重RT-PCR法对PEDV和TGEV具有很好的特异性;临床样本的检测结果显示,二重RT-PCR法与单项RT-PCR法检出率基本吻合。说明试验建立的PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法可用于猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病的快速鉴别诊断。

摘要：【目的】了解福建省NADC30-like PRRSV FJLY01株的分子生物学特征和遗传演化规律,为PRRSV的防控提供参考。【方法】对采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,以NADC30PRRSV毒株基因序列为参考设计并合成9对引物,分别对分离株序列进行分段PCR扩增,经克隆测序后进行序列拼接,采用MEGA 6.0软件进行核苷酸及氨基酸同源性比对,并绘制其与其他35株毒株的系统遗传进化树。【结果】FJLY01株基因组全长为15 016bp(不包含polyA),包含10个开放阅读框,5′-UTR长190bp,3′-UTR长148bp,Nsp2基因缺失393bp。Nsp2蛋白存在类似PRRSV MN184和NADC30株的131个氨基酸的缺失。核苷酸比对结果表明,FJLY01株与VR-2332、MLV RespPRRS/Repro、CH-1a和BJ-4株核苷酸的同源性为85.2%~86.3%,与JXA1、HuN4等HP-PRRSV株核苷酸的同源性为83.7%~84.1%,与MN184A、MN184B株核苷酸的同源性为87.9%~88.2%,与NADC30株核苷酸的同源性最高,为97.1%。系统进化树分析表明,该毒株属于NADC30-like毒株,与JXA1、VR2332和CH-1a的亲缘关系较远。【结论】福建省存在NADC30-like毒株,应该加强PRRSV的监测。

摘要：根据GenBank公布的猪瘟病毒(CSFV)标准参考毒株全基因组序列,设计11对引物,应用RTPCR方法分别对11个片段进行福建流行毒株CN-FJLY的全基因组扩增,与参考毒株进行序列分析比较。结果表明,福建流行毒株CN-FJLY基因组全长为12 296bp,与参考毒株SXCDK、HEBZ、GXWZ02、HNLY-2011和Zj0801的全基因组核苷酸同源性为93.0%～97.0%,而与1.1亚群的中国强毒Shimen、疫苗株HCLV全基因组核苷酸同源性为84.4%～85.3%。基于全基因组及E2基因构建的遗传进化树分析结果表明福建流行毒株CN-FJLY属于2.1b亚群,与Shimen株、HCLV疫苗株亲缘关系较远。与HCLV相比较CN-FJLY基因组变异较大的是5′UTR、Ems、E2、p7、NS2、NS5A、NS5B和3′UTR。综上说明福建省猪瘟病毒流行毒株正在向远离疫苗株的方向变异。

摘要：根据6型猪细小病毒(porcine parvovirus 6,PPV6)和4型猪细小病毒(porcine parvovirus 4,PPV4)全基因组的保守区域基因序列,分别设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的Taqman探针。经过条件优化,建立能够同时诊断PPV6和PPV4的双重荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性、稳定性以及与常规PCR方法的符合率进行研究。结果显示,该方法能够同时检测鉴别PPV6和PPV4,且特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及猪细小病毒1型核酸均无交叉反应;本方法灵敏性强,PPV6和PPV4的最小检出限分别为7.7拷贝/μL和9.3拷贝/μL;组间和组内变异系数均未超过2%,具有良好的重复性;利用所建立的双重荧光定量PCR方法对福建省采集的68份猪血清及20份组织样本进行检测,PPV6阳性率为37.5%(33/88),PPV4阳性率为12.5%(11/88),混合感染率为11.36%,该结果与常规PCR的符合率分别为81.8%(PPV6),90.9%(PPV4)和90.05%(混合感染率),并且常规PCR鉴定的阳性样品通过本研究建立的方法复检时均未出现漏检。结果表明,本试验建立的检测方法对PPV6和PPV4的鉴别诊断、病原监测、流行病学调查等具有重要意义。

摘要：猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒2型(PPV2)均为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的潜在致病病原。为了建立一种高效、快速、准确且能够同时鉴定PCV2和PPV2的双重PCR方法,下载GenBank已公布的多个PCV2及PPV2全基因序列并比对,针对PCV2和PPV2基因组的保守序列设计合成2对PCR引物,对双重PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PCV2和PPV2的双重PCR方法,并对其敏感性,特异性及与普通单一PCR的符合率做出评价。结果显示,该方法能同时扩增出666 bp(PCV2)与254 bp(PPV2)的特异性片段,对阳性标准质粒pMD-PCV2和pMD-PPV2的检测限分别为1.0×10^(2)copies/μL和1.0×10^(1)copies/μL,对猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒1/4/6/7型和猪圆环病毒3/4型的核酸扩增结果均为阴性。对临床疑似患PRDC的86份肺部组织样品进行检测,结果显示,PCV2阳性率为30.2%,PPV2阳性率为59.3%,两者的共感染率为20.9%,与单一PCR检测结果一致。结果表明,本研究建立的双重PCR方法可有效、特异、灵敏、快速鉴定PCV2和PPV2,为PCV2和PPV2的快速检测及其流行病学调查提供有效的技术手段。

摘要：为快速检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-2)并从中鉴别诊断NADC30-like PRRSV,根据PRRSV-2的ORF6基因及类NADC30的2个靶点Nsp9和ORF5基因片段分别设计3对特异性引物和探针,建立了一种三重荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,Ct值与标准品在1×10^(9)-1×10^(1)拷贝/μL范围内存在良好的线性关系,R2均>0.990,最低检测浓度为10拷贝/μL;该方法特异性强,与其他基因亚型的PRRSV和其他主要猪源病毒无交叉反应;重复性分析结果显示,组内、组间变异系数均小于1%,呈现出良好重复性。应用建立的三重荧光定量RT-PCR检测方法对116份NADC30-like PRRSV样品进行检测,符合率为98.28%,对458份临床样品进行检测,2对引物单独使用时对NADC30-like PRRSV的检出率分别为36.03%(165/458)和32.3%(148/458),而2对引物同时使用时,NADC30-like PRRSV的检出率明显提高,为44.5%(204/458)。因此,本研究建立的三重荧光定量RT-PCR检测方法可用于PRRSV-2检测,可快速区分出NADC30-like PRRSV,可为PRRSV的防控提供技术支持。

摘要：猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR GreenⅠqPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×10^(2)拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR GreenⅠqPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检测方法的阳性率分别为24.67%(37/150)和6.67%(10/150),二者的总符合率为80.67%(121/150)。表明本研究建立的qPCR方法可以用于临床样品的检测。本研究建立的qPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性稳定性好,为PPV7的流行病学调查及检测提供了新的技术支撑。

摘要：为建立同时检测淡水鱼中华支睾吸虫、东方次睾吸虫和日本全冠吸虫的三重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的各吸虫参考序列中保守区域设计3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了3种吸虫囊蚴的多重PCR检测方法,并利用该方法对52尾淡水鱼样品中吸虫囊蚴的感染情况进行检测。结果显示,本研究所建立的方法对东方次睾吸虫、华支睾吸虫、日本棘隙吸虫能分别扩增到508 bp、311 bp和208 bp的目的条带,对鸭对体吸虫、舟形嗜气管吸虫、横川后殖吸虫和卷棘口吸虫的基因扩增结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法对3种吸虫囊蚴重组质粒标准品检测下限均为104拷贝/μL。利用该三重PCR方法对淡水鱼临床样品进行检测,结果显示该方法与形态学检测方法结果一致。本研究在国内首次建立了淡水鱼3种吸虫囊蚴多重PCR检测方法,为鱼源性吸虫病的快速检测及鉴别诊断提供了技术手段,为鱼源性寄生虫病的防控奠定了基础。